蛋白质修饰

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1、 1 蛋白质化学修饰蛋白质化学修饰 翻译后修饰发生规律是理解蛋白质复杂多样的生物功能的重要前提。 蛋白质药物在使用中出现的问题蛋白质药物在使用中出现的问题 ？ TC实际浓度理想浓度药用蛋白质受制约药用蛋白质受制约(抗原性、半衰期） 外源蛋白质属于天然抗原，注射到机体内: 会受到各种蛋白酶的攻击而失去生物活性； 会引发抗体的产生，通过抗原抗体反应而被清除，严重的甚至会引起过敏反应； 会因为半衰期过短(尤其是小分子蛋白质)，无法充分发挥其生物功能。 那么，降低药用蛋白的抗原性，延长半衰期，确保那么，降低药用蛋白的抗原性，延长半衰期，确保生物活性的方式：生物活性的方式： 化学修饰 蛋白质交联 基因突

2、变方式 2 (图)改变目的蛋白性质的修饰方式 第第一节一节 概概 论论 蛋白质变性或蛋白质变性或 去折叠去折叠 化学结构不发生改变，空间结构破坏 导致蛋白质生物学功能的丧失的过程。 Why?Why? 蛋白质重要的生物大分子生命活动的主要承担者 蛋白质的生物学活性决定于特定的化学结构, 还决定于特定的空间结构。 蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰 （Modification-specific）“装饰装饰” 蛋白质分子化学结构发生的改变。 广义上：通过活性基团的引入或除去， 使蛋白质一级结构发生改变的过程。 非必需部分的修饰非必需部分的修饰（少） 化学结构改变并不影响蛋白质的生物学活性的修饰。 化学

3、修饰 异质二聚体 异质多聚体 蛋白质交联 基因修饰 同质二聚体 同质多聚体 蛋蛋 白白 质质 3 但在大多数情况下： 蛋白质化学结构的改变将导致生物活性的改变。 蛋白质的化学修饰主要蛋白质的化学修饰主要涉及涉及： 蛋白质分子的侧链基团的改变； 蛋白质分子中主链结构的改变。 化学修饰化学修饰的用途：的用途： -研究蛋白质的结构与功能关系的一种重要手段， -定向改造蛋白质性质的一种有力工具。 蛋白质侧链基团的化学修饰蛋白质侧链基团的化学修饰方法：方法： 通过选择性试剂(修饰剂)或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团(功能基)发生化学反应而实现。 广泛使用的研究手段, 比较成熟的经典技术,

4、研究蛋白质或酶的结构与功能。 主要作用主要作用: : (1)(1) 探测酶和蛋白质的必需 aa 残基的性质和数目 揭示蛋白质分子中哪些侧链基团是表现酶活住所必需的。 对 于 空间结构尚未搞清楚的蛋自质分子尤为重要,它可以帮助初步认识该蛋白质分子中哪些蛋白质侧链基团的化学修饰 主链结构的改变主链结构的改变，属于基因重组和定点突变的技术 4 残基能处于活性部位，并为其表现功能所必需。这将为空间结构的解析提供重要的信息。 ( (2)2)用于蛋白质纯度分析与鉴定 ( (3 3) )用于蛋白质一级序列的测定 N-末端残基的分析常用的修饰试剂： 二硝基氟苯(DNFB,dinitrofluorebenzen

5、e)、 丹氟酰氯:二甲基氨基萘磺酰氯(DNS, dimethylamimno-naphthalene) 苯异硫氰酸酯(PITC, phenyl isothiocyanate) 半胱氨酸残基的测定、二硫键的断裂、侧链基团的保护等 均采用各神方法的化学修饰。 (4)(4)探测蛋白质分子的构象变化和运动性 利用化学修饰试剂的反应,探测某些基因的暴露程度,以分析蛋白质分子的构象变化,如利用 5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸,DTNDTNB B)测定不同去折叠状态的反应巯基数目,可以探测其去折叠的程度,还可以通过监测 A412随时间的变化探测去折叠的动力学。 ( (5 5) )利用亲和标记探测活性部位局部

6、区域的构象状态 有些化学试剂可专一性地修饰酶的活性部位的侧链基团,从而在活性部位引入探测基因(如具有荧光性或顺磁性基团),以探明活性部位的构象状态及构象变化。 (6)(6)探索蛋白质和酶作用的化学机理 通过化学修饰可以探明哪些侧链基团参与了酶的催化作用,为探明其作用的化学机理和催化历程起了重要的作用,也为药物设计提供了分子基础 5 (7)(7)利用共价交联技术研究蛋白质分子的拓扑学、构象的运动性以及寡聚蛋白质的亚基结合状态。 (8)(8)利用蛋白质晶体的重金属衍生物(也属于一种化学修饰),进行 X 衍射晶体结构分析。 (9)(9)用于蛋白质和酶分子的固定化 在蛋白质和酶分子的固定他技术中， 除

7、部分用物理方法固定外,主要的还是采用化学方法的固定化固定化。其本质其本质是蛋白质和酶的比学修饰，其中包括中包括载体偶联法和共价交联法。 这类化学修饰希望只修饰非必需幕闭,设法避免必需基团的破坏,以保持蛋白质和酶的活性。 (1(1O)O)定向改造蛋白质分子的性质 用基因定点突变技术基因定点突变技术,改变蛋白质主链的化学结构改变蛋白质主链的化学结构,在蛋白质的肽链结构中删去、 替换或增加某些 aa 残基,以研究其结构与功能的关系,并可定向地进行蛋白质的改造。 此外,还可以通过侧链基团的化学修饰侧链基团的化学修饰,改造蛋白改造蛋白质质分子的性质分子的性质,如使其激活、失活,或使其稳定性提高等。 蛋白

8、质化学修饰一种有效的研究手段 广泛地应用于基础性研究和应用研究。 蛋白质错综复杂三维结构蛋白质错综复杂三维结构的影响：的影响： 蛋白质分子的所有 AA 残基的侧链基团分布于蛋白质分子的各个部分。 有的残基处于蛋白质分子的表面,易于受到试剂的进攻和作用,有的残基则内埋于蛋白质分子的疏水内环境.不易与试剂接触和反应, 即使都处于能与试剂作用部位的同类基因,由于它们所处的化学微环烧6 不间,因此与试剂作用反应速度也不相同。 那么那么，不同的研究目的,对化学修饰反应发生的部位也有一定的要求。 【例例】若若需需测定某一蛋白质的表面可反应巯基数, 那么修饰试剂(如 DTNB)与蛋白质的反应需在天然条件下进

9、行,避免因变性引起深度修饰反应的发生。 若需若需要测定蛋白质的总巯基数,则应在变性条件下(如在 8mol/L 脲或盐酸胍溶液中),使蛋白质分子充分去折叠而使其所有的内埋巯基都充分地暴露出来,以便试剂与之作用。 有的化学修饰反应需专一有的化学修饰反应需专一性性的发生于的发生于蛋白蛋白质分子的某一质分子的某一特特定部位定部位 【例例】要专一位修饰酶分子的活性部位侧链基因，这时就需对化学修饰试剂本身有特定的要求,使其能专一性标记于酶的活性部位， 常用的修饰方法是亲和标记。有的研究工作希望化学修饰后引起酶的失活；有的则希望化学修饰后保持酶的活性.因此在进行化学修饰时,应视不同要求来选择试剂和控制反应条

10、件。 修饰蛋白质修饰蛋白质研究是“冰山的一角”研究是“冰山的一角” Why？ 翻译后修饰蛋白质的化学计量值低、复杂性大。基因转录产物mRNA 的可变剪接以及翻译中和翻译后修饰导致了基因产物的多样性。 【例例】人类基因组包含大约30 000个ORF，平均每1个可阅读框可产生56个不同的mRNA，每1个mRNA 翻译生成的蛋白质以不同的方式进行加工，每个多肽链大约可产生810种不同的修饰。 翻译后修饰还存在时空特异性、修饰类型及修饰程度随生物生存环境及内在状态的变化会表现出极大的差别，有的修饰甚至是转瞬即逝的。 7 需要更特异有效的富集分离方法、更高灵敏度和质量精度的质谱检测鉴定方法； 检测技术仅

11、集中在鉴定修饰类型，然而，生物体的变化常常是由于修饰程度的改变引起的,因而,定量研究翻译后修饰尤为重要； 高通量导致海量的蛋白质鉴定，但如何确保产出数据的可靠性,目前修饰蛋白的鉴定主要采用数据库检索和人工读图相结合的方法。 蛋白质的分子结构是复杂的,要严格控制反应发生在某一位点上是有困难的。然而,可以通过反应试剂的选择与设计、反应条件的控制与改变、采用某些保护措施等等。做到使反应主要发生于某一特定位点。 酶的不可逆抑制作用酶的不可逆抑制作用= =化学修饰 大多化学修饰导致酶的不可逆失活,故又称酶的不可逆抑制作用酶的不可逆抑制作用。 那么，那么，用于化学修饰的试剂称为酶的不可逆抑制剂。 研究酶活

12、性不可逆改变动力学： 为酶的催化作用机理的阐明提供重要的信息和实验依据, 为药物设汁提供重理的信息。 必需基必需基团团 侧链基团的改变有可能导致生物学活性的改变，这类基团一般称为必需必需基基团团。一般说来,必需基团的改变将导致蛋白质生物学活性的下降或丧失。 非必需基非必需基团团 某些基团的破坏,对蛋白质生物学功能没有影响,这类基团一般称为非非必需基必需基团团。 8 【注注注注】 ：这类非必需基团的所谓非必需性仅因其破坏对活性没有影响而言,这些非必需基团的AA残基对于维持蛋白质特定的空间结构是有作用的,有的则是非常重要的。 总之，利用化学修饰很快可以获得未知蛋白质的初步认识, 并同时监测某些基团

13、的改变和其生物活性的改变。 第第二节二节 蛋白质侧链基团的修饰反应蛋白质侧链基团的修饰反应 一、一、化学修化学修饰原理饰原理 通过化学修饰剂与蛋白质分子侧链上的特定功能基团发生化学反应。 只有具有极性极性的aa残基的侧链基团才能够进行化学修饰。 修饰反应：酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型 修饰部位：巯基、氨基和羧基等侧链基团。 修饰反应性的决定因素 选择吸附；静电相互作用；位阻因素；催化因素；局部环境的极性。 影响蛋白质化学修饰反应的主要因素：影响蛋白质化学修饰反应的主要因素： 蛋白质功能基的反应活性； 修饰剂的反应活性。 影响蛋白质功能基反应活性的因素：影响蛋白质功能

14、基反应活性的因素： 基团之间的氢键和静电作用等； 基团之间的空间阻力。 功能功能基的反应活性基的反应活性衡量衡量： 9 亲核性，或超反应性。 超反应性超反应性 指蛋白质的某个侧链基团与某种修饰剂能够发生超常速度的反应。 修饰剂的反应活性则主要取决于修饰剂上活性基团的类型。 侧侧链基团化学修饰链基团化学修饰探测活性部位的结构探测活性部位的结构： 反应试剂与蛋白质分子接触发生化学反应与蛋白质分子的侧链 aa 残基共价连接形成某些可探测的报告基团。 理想情况下, 修饰试剂只是有选择地与某一特定的残基反应, 很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化, 在此基础上,从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所造成

15、的影响,就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子中的功能, 【注注注注】 ：在 20 种构成蛋白质的常见 aa 中,只有只有具有极性的 aa 残基的侧链基因才能够进行化学修饰， 这些基团的反应性取决于它们的亲核性。 很多因素都可以影响亲核性的大小,这些因素对蛋白质的化学修饰反应会造成较大的影响。 选择蛋白质修饰剂要综合考虑如下一些问题：选择蛋白质修饰剂要综合考虑如下一些问题： 修饰剂的水解稳定性和反应活性； 蛋白质的修饰位点， 修饰剂与蛋白质上的 AA 残基之间的反应类型和专一性； 要求的修饰度； 修饰剂与蛋白质的连接键的稳定性、毒性、抗原性； 10 修饰后是否需要进一步分离； 是否适于建立快速、方便的分析方法； 修饰剂是否能够简便经济地合成或购买。 蛋白质修饰剂蛋白质修饰剂类型类型: : 小分子修饰剂小分子修饰剂: :如乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺、碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺等. 大分子修饰剂大分子修饰剂：如聚乙二醇、聚 aa、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、多聚唾液酸、葡聚糖、环糊精等。 区别区别: : 小分子修饰剂 大分子修饰剂 都能够与某一特定的 aa 残基的侧链基团发生化学反应，并形成共价键 多用于酶和蛋白质的各级结构 作用机理研究 蛋白质和酶分子的固定化 多用