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1、细胞工程原理与技术细胞工程原理与技术实验计划实验计划实验班级：07 级 指导老师：魏海明 吕新怀 郑晓东 张晓龙 金晶 实验室负责人：吕新怀吕新怀 , 3600453实验实验 1 HL-60 细胞的培养、传代、复苏和冻存细胞的培养、传代、复苏和冻存1、HL-60 细胞的培养与传代细胞的培养与传代（第一周）（第一周）1.1 实验分组83_人分 3 大组进入万级净化细胞间，每大组 27，27，29 人，分 9 个小组，每小组 3 人，实验材料准备及实验操作以小组为单位。 1.2 实验材料HL-60 细胞，无菌完全 RPMI-1640 培养液，无菌离心管，无菌吸管，无菌培养瓶，离心机，倒置显微镜，超
2、净工作台，CO2 培养箱等。1.3 实验方法HL-60 细胞为悬浮细胞生长的细胞，可在完全 RPMI-1640 培养液中培养，该培养液由 90不完全 1640 培养液RPMI-1640 液 95 毫升；0.1M 丙酮酸钠 1 毫升；0.2M 谷氨酰胺 1 毫升；1M Hepes 1 毫升；7.5 NaHCO 1 毫升；青霉素、链霉素(各 1 万单位) 1 毫升和 10灭活胎牛或新生牛血清。传代时不必采用酶消化法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。通常采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一起转移到离心管内，离心 800rpm5min, 然后去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞
3、悬液，然后传代接种。根据细胞数量，可采用1 瓶传 3 瓶或其它比例传代。2 HL-60 细胞的冻存细胞的冻存（第一周）（第一周）2.1 原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在130以下的低温中能减少冰晶的形成。为了避免污染造成的损失，最小化连续细胞系的遗传改变和避免有限细胞系的老化和转化，需要冻存哺乳细胞。冻存细胞前，细胞应该特性化并检查是否污染。目前常用的保护剂为二甲亚砜（
4、DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。2.2 试剂和器材2.2.1 器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管） 、离心管、吸管、离心机等。2.2.2 试剂：0.25胰酶、RPMI-1640 培养基、含保护剂的培养基（即冻存液） 。2.2.3 冻存液配制培养基加入甘油或 DSMO，使其终浓度达 520%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后 4下保存。有几种普通培养基用来冻存细胞。对于包含有血清的培养基，成分可能如下：*包含 10甘油的完全培养基，*包含 10二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基，*50 细胞条件培养基和 50含有 10甘油的新鲜培养基，或*50
5、 细胞条件培养基和 50含有 10二甲基亚砜的新鲜培养基。对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是：*50细胞条件无血清培养基和 50包含有 7.5二甲基亚砜的新鲜无血清培养基或 *包含有 7.5二甲基亚砜和 10细胞培养级 BSA 的新鲜无血清培养基。2.3 方法与步骤2.3.1 消化细胞（贴壁细胞） ，将细胞悬液收集至离心管中。2.3.2 1000 rpm 离心 10 分钟，弃上清液。2.3.3 沉淀加含保护液的培养，计数，调整至 5106/ml 左右。2.3.4 将悬液分至冻存管中，每管 1ml。2.3.5 将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。2
6、.3.6 贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。2.3.7 按下列顺序降温：室温 4（20 分钟） 冰箱冷冻室（30 分钟） 低温冰箱（30 1 小时） 气态氮（30 分钟） 液氮。2.4 注意事项操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般 30 立升的液氮能用 11.5 月。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。3 3 冻存细胞的复苏冻存细胞的复苏 （第二周）（第二周）冻存细胞比较脆弱，要求轻柔的操作。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。冻存细胞融化后，应当直接加入完全生长培养基中。如
7、果细胞对冻存剂（DMSO 或甘油）特别敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。3.1 取出贮存细胞，37 水浴中快速融化。3.2 把 1 到 2 ml 冻存细胞加入到大约 25ml 完全生长培养基，轻轻混匀。3.3 以大约 800 rpm 离心 2 到 3 分钟，弃去上清。3.4 在完全生长培养基轻轻再次悬浮细胞，并且进行活细胞计数。3.5 细胞铺板，细胞接种应该至少为 3105活细胞/ml。实验实验 2 2 流式细胞仪原理及细胞凋亡分析（第二周）流式细胞仪原理及细胞凋亡分析（第二周）流式细胞仪（
8、flow cytometry） ，又叫荧光激活细胞分选器（FACS） ，多数流式只是个零分辨率的仪器，也就是细节分辨率为零。因为它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白理等指标，而不能鉴别和测定出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。流式细胞术是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：测量速度快，最快可在 1 秒种内计测数万个细胞；可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
9、概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。1 主要工作原理当单个细胞通过一个聚光束时，系统会测定几个参数。这些参数是通过测量细胞的荧光和它们散射光的主要方式确定。计算机给所有数据分类并绘图。1.1 其流动装置的主要原理是：标本样品被制成单细胞悬液，经染色进入流动室，流动室里充满鞘液。由于鞘液压力与样品流压力不同，当二者差异达到一定程度时，鞘液会裹挟着样品流中的细胞排成单列逐个通过激光聚焦区。1.2 光学部分的原理:光照到细胞上，会发生散射。散射光分为前射光和侧散射光。如果散射光方向与入射光相同，叫前散射光：成 900方向散射，叫侧散射光。激
10、光由聚焦镜聚焦照到细胞流上，前散射光由光电二极管接收。侧散射光和激发荧光由荧光收集透镜收集，再经一个二向色性反射镜和过滤器分离。反射镜分为 SP 和 LP。SP 允许短波通过，反射长波的光。短波光由 FL1 光电倍增管接收，同时也分离出 10%左右的侧散射光。长波光照到 LP 上，又分离出稍长波长的光，由 FL3 光电倍增管接收；同时，稍短一线波长的光被反射，有 FL2 光电倍增管接收。总而言之，光照到细胞上，光电倍增管将光信号转换成电信号。再由放大器把信号放大，再由模/数转换器将电信号变成数字信号，在计算机上显示出来。流式的应用很广泛，功能很强大，主要有以下几个方面:细胞表型分析;染色体分类
11、研究;血小板研究;细胞凋亡分析;分选;细胞内 Ca 离子测量的研究。2 流式细胞仪的主要应用软件：CellQuest显示数据的图有：2.1 直方图，用于定性定量分析，纵轴表示细胞相对数，横轴一般为道数（荧光强度）2.2 点图，横纵轴为与细胞有关的任意两个独立参数，可由它得到两个一维直方图。在图上你可以划出四个象限，来判断分析。2.3 二维等高图每条连续曲线上有相同的细胞相对或绝对数，即等高。曲线层次越高则表示细胞数越多，曲线越密集表示细胞变化率越大，越稀疏表示越平衡。3 流式细胞仪被检材料要求3.1 单细胞悬液3.2 被检细胞或其他单个粒子大小在 0.2150um 之间3.3 一份样被检细胞的
12、数目在 1000 个以上流式细胞仪的分析速度 5000-104个细胞/秒4 补偿在做多染时，必须要调补偿。所有的荧光染料发射光的波长都有个范围，它们之间有些重叠的区域。一种荧光染料的信号也会被其它荧光染料的探测器接收到，例如：FITC 发射的光本来应由FL1 探测到，但部分波长的光也会进入 FL2 探测的波长范围内被其探测到，这样一来可能产生假阳性，所以要把这部分波长的光补偿掉。5 细胞分选流式可以进行细胞分选。这是通过分离含单细胞的液滴实现的。在流动室的喷口上有个超高频的电晶体，充电以后会振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞分散于这些液滴中。先选定某个参数，细胞通过时会由逻辑电路根据
13、参数值判断是否是你要分选的细胞。充电电路再对选定的细胞和没选的细胞充上不同的电荷，实现细胞的分离。6 样品制备和检测分析6.1 收集冬凌草甲素（oridonin）处理 48h 的 HL-60 细胞，2000rpm5min 离心，弃上清；6.2 1ml Binding buffer 洗涤细胞一次，2000rpm5min 离心，弃上清；6.3 加入 100l Binding buffer 重悬细胞；6.4 按细胞凋亡试剂盒说明对细胞进行 Annexin V 与 PI 染色。 6.5 将染色好的样品分装到流式细胞仪专用管中。6.6 打开 cellquest 软件开始获取细胞，调参数。6.7 从 FS
14、C、SSC 组成的点图中设门，排除细胞碎片和聚集体。6.8 得到横轴为 Annexin、纵轴为 PI 强度点图，加以数据分析。数据分析可以计算凋亡细胞、坏死细胞、正常细胞的百分比。实验实验 3 CHO-K1 细胞的培养（第三周）细胞的培养（第三周）1 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养） 。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。2 材料和试剂细胞：CHO-K1 细胞试剂：0.25胰酶、1640 培养基（含 10小牛血清）仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸
15、等3 方法与步骤3.1 选生长良好的细胞一瓶，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起浮着在细胞表面的碎片，然后连同生长液一起倒出，用 Hanks 液洗一次。3.2 从无细胞面侧加入 0.25胰蛋白酶液或胰蛋白酶EDTA 消化液 45 ml，翻转培养瓶，使消化液浸没细胞 1 min 左右。消化最好在 37 或室温 25 以上环境下进行。3.3 翻转培养瓶，放置 510 min，为促进细胞的消化，可以加入 37 预热的消化液，或在细胞面向上时，用手掌贴着细胞面的瓶外壁，待肉眼观察细胞面出现布纹孔状为止。3.4 倒出消化液，如系 EDTA 消化，需沿细胞层的对面加 Hanks 液 4.5m1 洗涤，洗涤时轻轻转
16、动培养瓶，让液体在瓶内慢慢流动，以洗掉消化液；如系胰蛋白酶消化，倒掉胰酶后可不洗涤。3.5 沿细胞面加入适量新配制的生长液，洗下细胞，并用吸管吹打数次，使细胞分散开，按 1：2或 1：3 分配传代培养。3.6 37 培养，接种后 30 min 左右可贴壁，48 小时可换生长液，一般 34 天可形成单层，形成单层后再换维持液供试验用。4注意事项4.1 操作前要洗手，进入超净台后手要用 75%酒精或 0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。4.2 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。4.3 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4.4 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。4.5 瓶子开口后要尽
