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1、华中科技大学硕士学位论文材料和方法一、主要仪器37恒温培养箱倒置相差显微镜PCR 扩增仪HMISAS-2000 型全自动流式细胞仪德国 Heraeus日本 Olympus M08 型杭州博日 PC-XP-D 型同济千屏影象工程公司医学彩色图文分析系统Becton Dickinson二、主要试剂葛根素氧自由基DMEM 培养液胰蛋白酶透明质酸酶胎牛血清鼠尾胶原SABC 试剂盒DAB 试剂盒因子抗体反转录试剂盒Taq 酶Bcl-xL、Bax 引物4山东鲁抗制药Sigma 公司Hyclone 公司Sigma 公司Sigma 公司Hyclone 公司Hyclone 公司武汉博士德生物公司武汉博士德生物公
2、司武汉博士德生物公司日本 Toyobo 公司Fermentas 公司上海 Sangon 公司华中科技大学硕士学位论文三、实验动物重量 200-300g 的正常杂色豚鼠，为中科技大学同济医学院动物实验中心提供。四、实验方法1.豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的培养，纯化，及鉴定豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的培养参照魏运军等6的方法并改进。1.1 豚鼠耳蜗血管纹组织的分离选取重量 200-300g 的正常杂色豚鼠 10 只，雌雄不限。以 1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，断头，取出双侧听泡，用 75%酒精浸泡 5 分钟，浸入 D-Hanks 液中，解剖显微镜下剪去听泡骨壁，刮除耳蜗表面的骨膜，钩破蜗尖
3、，自顶回至基底回完整剥离出耳蜗外侧壁软组织，仔细分离出含深色色素的血管纹，并将其切碎成 0.5mm 大小的微小组织块，均匀平铺于直径为 35mm 的培养皿中备用。1.1.2 胶原酶消化法及细胞纯化养皿中加入 3ml 0.1%型胶原酶(Sigma)工作液，置 37恒温箱中振荡消化 1 小时，去除未消化掉的组织残块，离心(1000g/10min)， 所得沉淀加入含 25%胎牛血清的 DMEM 培养液，并接种于直径 35mm 的培养皿中(事先加有鼠尾胶原)，置 5%CO2，37培养箱中培养 2-7 天内，可观察到培养皿底有多个细胞岛形成，每三天更换 1/2 的培养液，同时每日在倒置显微镜下刮去散在的
4、可疑杂细胞，15-30 天后，当细胞已接近长满培养皿底时，0.5%胰蛋白酶消化 5min，按 105/cm2 的细胞密度接种传代，台眙蓝染色并计数。1.1.3 内皮细胞的鉴定培养皿底放入盖玻片并固定，将培养细胞接种其中， 将生长于盖玻片上的第四代培养细胞用 4%多聚甲醛固定，PBS 冲洗后加 3% H2O2-甲醇 37孵育 30min，10%羊血清封闭，加入 1：100 的兔抗鼠因子抗体 4湿盒过夜，PBS 冲洗 3 次后加入1：100 的羊抗兔 IgG，充分冲洗后加入 1：100 三抗，DAB 显色，复染液复染后摄片，空白对照用 PBS 代替因子抗体，其余步骤不变，阴性对照则使用豚鼠肝细5华
5、中科技大学硕士学位论文胞。2. 药物实验：将 24 孔板分为 5 个组：空白对照组、氧自由基组、葛根素处理组，葛根素处理组又分为三个浓度组，每组设 5 个复孔。将葛根素按终浓度配制为 0.5mmol/L，1.0mmol/L， 3.0mmol/L；用培养液作为溶剂，配成 3-30ul 母液，分别加入葛根素预处理组的相应培养孔内，对照组及氧自由基组则加入等体积相同培养液做对照。培养箱中继续培养 12 小时。3. 黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生 OFR 损伤耳蜗微血管内皮细胞模型的建立在葛根素作用 12 小时后的葛根素预处理组及未经葛根素作用的氧自由基组的培养基中加入次黄嘌呤 (终浓度为 0.1mmol/
6、L)和黄嘌呤氧化酶溶液 (终浓度为 0.05U/ml)，作用 60 分钟后用 D-Hanks 液洗两遍，然后换上含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液，37，5% CO2 培养箱中继续培养，对照组不加氧自由基，其他处理同上。培养 24 小时后，取出培养有豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的盖玻片，4%多聚甲醛固定 30分钟，PBS 液漂洗 5 分钟，重复 3 次。分组标记。4. 流式细胞术检测细胞凋亡率主要检测指标为凋亡细胞所占百分比(%)，经上述各组耳蜗微血管内皮细胞经胰酶消化后用吸管轻柔吹打成单细胞悬液后，加 0.1mol/L PBS，离心洗 2 次，加入2mL 冷 70%乙醇固定，调整细胞浓度为 1
7、x106cells/mL，室温放置 30min 后，离心，检测前加入碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染色，300 目筛网过滤处理后，置流式细胞仪中进行细胞周期和细胞凋亡的测定，按细胞周期曲线上出现的凋亡细胞峰计算各时间点凋亡细胞所占百分比(%)。全部操作在华中科技大学附属同济医院中心实验室完成，流式细胞仪(BectonDickinson)的工作条件为氩离子激光器 Innova9025 激光功 率 为 15mV ， 激 光 波 长 为 488nm， 检 测 结 果 经 过 B.D. 公 司 Cell QuEST 和ModFIFLF formacvl.01 处理.5. 免疫细胞化学
8、染色检测凋亡相关蛋白 Bax/Bcl-xL用 ABC 法，将细胞按上述方法分组，同时培养 24h 后将培养液吸去，加0.1mol/L PBS 洗 2 次，用 4%的多聚甲醛固定 30min，以 10%的新生牛血清室温封闭6华中科技大学硕士学位论文20min 后，加一抗 4湿盒内孵育过夜，一抗为兔抗鼠 Bax 与 Bcl-xL 多克隆抗体，工作浓度为 1:100，以下实验按 ABC 免疫组化试剂盒和 DAB 试剂盒说明书操作，其中二抗为山羊抗兔多克隆抗体，工作浓度 1：50。胞质出现黄褐色者为阳性细胞。Leica 倒置相差显微镜下对典型视野 200 倍放大后进行显微摄影.用 HMISAS-200
9、0 型全自动医学彩色图文分析系统对细胞片进行分析处理得到平均灰度值。6. RT-PCR检测Bax/ Bcl-xL mRNA表达反转录试剂盒（Toyobo 公司），Taq 酶（Fermentas 公司），PCR 扩增仪（杭州博日），Bcl-xL 引物及内参照（上海 Sangon）。收集氧自由基作用下培养的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞用一步法提取总 RNA，分光光度计计测定 RNA 含量并调整浓度。将 3ug 的总 RNA 反转录成 cDNA，豚鼠 Bcl-xL 的引物序列：上游为 5-GTAGTGAATGAACTCTT TCGGGATGG-3，下游为 5-AGCCACAGTCATGCCCGTCAGG-
10、3 ， 扩 增 后 片 段 长 度 为 288 bp 。 豚 鼠 Bax 的 引 物 序 列 ： 上 游 为 5-GGGTTTCATCCAGGATCGAGCAG-3，下游为 5-GAGTCCGTGTCCACGTCAGCAAT-3，扩增后片段长度为 238 bp。以 b 肌动蛋白 mRNA 水平作为内参照，其引物序列：上游为：5-CAGTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3，下游为：5-AGGTCATCACTATTGGCAACGAG-3，扩增后片段长度为 420 bp。PCR 扩增条件：94 变性30s，58 退火 60s，72 延伸 90s，35 次循环，最后延伸 7min。扩增产物经
11、 2%琼脂糖凝胶电泳后，对进行图像扫描分析，记录灰度值。7. 统计学方法所有研究数据应用 SPSS 13.0 软件包分析，组间差异的显著性用单因素方差分析法进行统计学检验，两两比较用 q 检验。7组别凋亡率 (%)对照组5.360.82氧自由基组16.322.23 葛根素预处理组氧自由基葛根素 0.5mmol/L13.581.81 *氧自由基葛根素 1.0mmol/L10.021.41 *氧自由基葛根素 3.0mmol/L6.871.08 *F 值28.46P 值0.000华中科技大学硕士学位论文结果1.豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的培养与鉴定豚鼠耳蜗微血管内皮细胞传代后约8d，经过大量增殖的培养细
12、胞紧密排列，融合成片状单层，显微镜下形成内皮细胞培养时典型的铺路石样外观(图1)用免疫组化法检查第因子相关抗原，95%以上细胞的胞浆中有棕黄色着色，即呈阳性反应(图2)。2 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 用PI染色后用流式细胞仪检测，氧自由基组可见明显凋亡阳性细胞，不同浓度葛根素组细胞凋亡率下降，氧自由基组和葛根素预处理组三个不同浓度葛根素组凋亡率比较，差异有显著意义（p0.05），提示葛根素的抗凋亡作用可能部分是由于上调原癌基因 Bcl-xL 蛋白及 mRNA 的表达来实现的，而与 Bax 的表达无关。以往研究显示25：葛根素预处理后，需要一定的潜伏期才能产生抗凋亡作用，提示这种保护作用可能
13、部分取决于其诱导和表达抗凋亡 RNA 及蛋白。本实验结果与上述认识相符合。而调节 Bcl-xL 的上游信号转导径路还不清楚，推测可能是其使细胞内 Ca2+ 超载，抑制线粒体膜上的 caspase 的激活，减少线粒体内 cytc 释放，抑制caspase-3，调节核内的细胞凋亡相关基因的表达（如上调 Bcl-xL mRNA）及平衡而抑制凋亡。通过上述途径，葛根素保护内皮细胞免受 NO 引发的凋亡。因此，葛根素的保护是由相互作用的细胞内多条通路介导的，而最终通过对凋亡因子的调节产生抑制凋亡的作用。本实验只观察了氧自由基作用后某一时间点的保护作用，到底作用多长时间开始产生保护作用？什么时候保护作用达
14、到最大效应？具体机制如何还需进一步研究。17华中科技大学硕士学位论文附图图 1 细胞接种后 8d,单层内皮细胞呈铺路石样外观 (X100)图 2 纯化后的第 4 代培养细胞,经免疫组化检测因子抗原胞质呈棕黄色阳性反应(X100)图 3氧自由基组，免疫组化检测 Bcl-XL 蛋白表达弱阳性，胞浆呈浅棕黄色，免疫组化染色200图 4 3.0mmol/L 葛根素组，免疫组化检测 Bcl-XL 蛋白表达阳性，胞浆呈棕黄色，免疫组化染色20018华中科技大学硕士学位论文图 5 RT-PCR 检测 Bcl-xL mRNA 的表达：A Marker，B 氧自由基组，C 0.15U/ml 葛根素组，D 0.3
15、U/ml 葛根素组，E 0.5U/ml 葛根素组，F 空白对照组；扩增产物长度288 bp，内对照为-actin，其产物长度 420 bp19华中科技大学硕士学位论文结论综上所述，葛根素对氧自由基诱导的凋亡具有耳蜗微血管内皮保护作用，该作用的产生可能部分与其上调 Bcl-xL 蛋白及 mRNA 表达而抑制凋亡有关，且在小剂量范围内（0.5mmol/L-3.0mmol/L）呈剂量依赖性。为葛根素成为耳蜗内皮保护剂提供了部分的实验依据。葛根素已经作为一种成熟的治疗心血管系统疾病的药物应用于临床多年，近来也逐渐用于突发性耳聋等耳蜗微循环障碍疾病的治疗，但是关于葛根素对耳蜗微血管内皮细胞通透性以及血迷
16、路屏障的保护作用及其机制还需深入研究，随着其作用机制的进一步阐明,葛根素的应用将会有一个巨大的发展。20华中科技大学硕士学位论文参考文献123456789Seidman MD,Quirk WS,Nuttall AL,et al. The protective effects of all opurinol andsuperoxide dismutase-polyethylene glycol on ischemic and reperfusion inducedcochlear damage. Otolaryngol Head Neck Surg .1991;105:457-463.Clerici WJ.Effects of superoxide dismutase and U74389G on acute trimethyltin-induced cochlear dysfunction. Toxicol Appl Pharmacol. 1996; 136:236
