《对某文献的主要内容概括》由会员分享，可在线阅读，更多相关《对某文献的主要内容概括（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Analysis of Active Center in Hyperthermophilic Cellulase fromPyrococcus Horikoshii摘要摘要 本文分析了一个来自 Pyrococcus Horikoshii 的热稳定的纤维素内切酶，这种内 切酶能够水解结晶纤维素。本文进行了蛋白质工程的研究并获得一个分子量减 小的突变体。本文发现在 N 末端和 C 末端可以同时缺失五个氨基酸残基，这种 缺失对其活性以及热稳定性没有任何损失。同时，本文对 R102,N200,E201,H297,Y299,E342,W377 几个氨基酸残基进行了定点突变， 这些残基可能与酶的活性中心或
2、识别与结合纤维素底物有关。这些点突变体的 酶活性大幅减小，这也证明了这些残基对于酶活性是很重要的。因此，在本文 中，获得了一个分子量减小但活性与野生型相当的酶,并确定了几个对活性有重 要影响的位点。主要内容主要内容 本文作者在之前在 Pho 中发现了一种超嗜热的内切葡聚糖酶 EGPh，这种酶可 以水解结晶纤维素。另外，在日本，已经建立起了一种大量产酶（kg-t）的方 法。鉴于此，作者希望研究结构与功能的关系，希望可能改善酶的作用,例如它 的特异性、热稳定性、耐极端酸碱。但是这种酶很难结晶，无法通过结晶的方 法来进行研究所以，本文通过一些生化的方法来研究酶的活性中心。 本文构建了一种来自 EGP
3、h 的分子量减小的纤维素酶，对活性中心的一些可能 位点进行了点突变，对以上的几种突变体进行了酶活性及最适 pH 的测定。并 通过差示扫描量热法进行分析，并对其热稳定性进行测定。 其中，作者通过用糜蛋白酶对蛋白 EGPh 在 37，进行 12h 消化，发现野生 型大小为 43KD，酶解后突变的蛋白为 40KD。通过蛋白质测序，发现其 N 端 可以去掉 5 个氨基酸。作者用同样的方法进行 C 末端的分析，发现其 C 末端也 可以去掉 5 个氨基酸。作者对野生型 WT,以及N5，C5，N5C5 三种突变体 的相对活性进行了测定，发现三种突变体活性与野生型相比活性都略有上升。 也对其动力学参数进行了测
4、定，虽然突变体的 Km 略高，但 Ka 也高于野生型， 总的来说差别不大。作者通过差示扫描量热法测得野生型与三种突变体的 Tm 值。分别是 100.1,98.9,95.5,95.3，总的来说，差别不大。在热稳定性实验中， N5, C5, WT,和N5C5 的总活性丧失所需要的时间分别是 2,3,4,6 天，可见 N5C5 突变体的热稳定性比野生型更好。通过以上几个方面的分析，可以说， 突变体不影响酶的活力以及热稳定性。 EGPh 与之前在 Acidothermus cellulolyticus 中发现的内切葡聚糖酶具有 43% 的序列一致性，这种酶的结构已经得到了很好的解析，因此，作者根据此内
5、切 葡聚糖酶的结构对 EGPh 进行突变。作者对野生型 EGPh，以及 E201Q,H297N,Y299F,E342Q,D385N,R102A,N200A,E201A,H297A,Y299A,E3 42A,W377A 等突变体进行了酶活性的分析，发现突变体活性大幅下降至很低，并且，作者对以上突变体的动力学参数进行了测定，与野生型相比都很低。除 野生型之外，作者选取 Y299F 进行了最适 pH 的测定，发现两者之间相差 3 个 pH 单位，活力降低。进一步说明了此位点对酶活性的重要性。 在本文中，作者通过对酶活性，动力学参数，最适 pH 等一系列的测定，获得 了一个分子量减小但活性与野生型相当的酶,并通过点突变的方法确定了几个对 活性有重要影响的位点 E201, H297, Y299, E342，以及一些有影响但较小的位 点 R102, N200, H297, Y299, W377。
