《PCR数据分析处理》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR数据分析处理（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2008-11-271PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶 链反应）是一种选择性体外扩增DNA或cDNA 的技术。特点：它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点。分类：最常用的FQ-PCR与RT-PCR。返回2008-11-272RT-PCR：逆转录PCR，将mRNA逆转录后再进 行PCR扩增 ，产物通过电泳检测基因的表达情况 ，又称半定量PCR。FQ-PCR：实时荧光定量PCR，在RT-PCR反应 体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监 测整个PCR进程，最后通过曲线对未知模板定量 的方法。联系及区别：RT-PCR只能进行定性；
2、FQ-PCR 才能做到定量。返回2008-11-273以FQ-PCR为例，体系中的组分如下 10buffer(Mg2+ free) MgCl2（25mM） dNTP（25mM） 上游引物（10 M） 下游引物（10 M） 探针或染料（10 M） Taq酶（5u/l） ddH2O cDNA模板返回2008-11-274stage1 94 2minStage2 探针：94 20sec，55（基因的复性温度） 20sec，60 30sec，45 cycles 染料：94 20sec，55（基因的复性温度） 20sec，72 30sec，80 20sec，45 cycles返回2008-11-275g
3、o2008-11-276返回2008-11-277用样本的基因的Ct值减去对应的内参的Ct值，得到 Ct值 例子：假设1号样本的基因的Ct值为23，1号样本的内 参的Ct值为19，则1号样本的Ct值=23-19=4。 根据Ct值就可以分析我们的基因的表达情况了， Ct值越大，则样本的基因的表达越低。取一个参照组的Ct值的平均值作为对照基准，用每 个标本的Ct值减去参照组的Ct值，得到Ct值 。 参照组是指你所要比较的对象，比如空白对照组等。计算出2-Ct值，就可以进行统计分析了。 2-Ct值的意义：每个样本的基因的表达是参照组的基 因表达平均值的多少倍？也就是我们说的相对定量。返回2008-1
4、1-278Rest软件分析后处理 分析完结果后，请根据需要给出拷图要求 通过书面或者邮件的形式给出下列要求 拷图主要是为了说明各组的表达的差异，也就 是选取每个组选出有代表性的标本组成一张图 。返回2008-11-279标准曲线有什么用？解答：标准曲线可以指示基因的扩增效率，并且在有 已知拷贝数的标准品的情况下可以算出标本的起始拷 贝数。但是我们做的大部分都是相对定量，就是看标 本间的表达的关系，并没有用已知拷贝数的标准品做 绝对定量的标准曲线，并且也没有必要做出他们的起 始拷贝数。我们只需要做出他们之间关系就可以了。 因此我们做的标准曲线就是指示基因的扩增效率，而 没有做出样本的起始表达量，我们也可以在图上看出 他们的关系，就是相对的倍数关系。扩增效率就是10- 1/k，其中k就是标准曲线的斜率。我们算出的效率基本 一致就可以了，那样我们的相对定量才成立，并且在 统计时，不一定要用算出的扩增效率，用2也是可以的 。 返回2008-11-2710Ct 值为什么不能机读？解答：如下图：机器读数是根据曲线与阈值线的交点对应的 循环数，但是如E4，因为曲线不规则，所以机器读数就不正 确，这种情况下只能采取人工读数的方法，而人工读数在肉 眼可见的情况下只能精确到0.1，这就是为什么大家拿到的数 据精确度只有0.1的原因。go2008-11-2711
