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1、薄层色谱法（二部）薄层色谱法（二部）1 简述简述 薄层色谱法（中国药典2010 年版二部附录 V B）系将供试品溶液点样于薄层板上， 经展开、检视所得的色谱图，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用于药品的鉴 别或杂质检查的方法。 2 仪器与材料仪器与材料 2.1 薄层板 2.1.1 自制薄层板 除另有规定外，玻板要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。 最常用的固定相有硅胶 G、硅胶 GF254、硅胶 H 和硅胶 HF254，其次有硅藻土、硅藻土 G、 氧化铝、氧化铝 G、微晶纤维素、微晶纤维素 F254、烷基硅烷键合硅胶等。其颗粒大小一 般要求直径为 540m 2.1.2 市售薄层板 分
2、普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶 GF254薄层板、 聚酰胺薄膜和铝基片薄层板等。高效薄层板的粒径一般为 57m。 2.2 点样器 有手动、半自动或自动点样器，一般采用微量注射器或定量毛细管。 2.3 展开容器 应使用适合薄层板大小的专用薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，底 部应平整光滑，或有双槽。 2.4 显色剂 按各品种项下规定。可采用喷雾显色、浸渍显色或置碘蒸气中显色，检 出斑点。 2.5 显色装置 喷雾显色可使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂 呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器皿或适宜的玻璃缸代替；碘汽熏碘显色可用 双槽玻璃缸或适宜大小的干燥器代替。 2.
3、6 检视装置 为装有可见光、短波紫外光（254nm） 、长波紫外（365nm）光源及相 应滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄色谱图用，暗箱内光源应有足够的光照度。 3 操作方法 3.1 薄层板制备 3.1.1 自制薄层板 自制薄层板一般可分为无黏合剂和含黏合剂两种。 3.1.1.1 无黏合剂薄层板系将固定性直接涂布于玻璃板上，除另有规定外，将 1 份固 定相和 3 份水，在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀， 或倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为 0.20.3mm） ，取涂好的薄 层板，置水平台上于室温下晾干后，在 110活化 30min，即置有
4、干燥剂的干燥箱中备用。 3.1.1.2 含黏合剂的薄层板，除另有规定外，系将固定相中加入一定量的黏合剂，一 般常用 10%15%煅石膏（CaSO4H2O 在 140加热 4h） ，混匀后加水适量，或用 0.2%0.5%羧 甲基纤维素钠水溶液（取羧甲基纤维素钠适量，加入一定的水后，放置使溶胀，加热煮沸 至完全溶解，放置，取上清液，即得）适量，在研钵中沿同一方向研磨混合调成糊状，去 除表面的气泡后，同 3.1.1.1，均匀涂布于玻璃板上。晾干，活化后，备用。 薄层板使用前应检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视） ，表面应均匀、平整、光 滑，无麻点，无气泡，无破损及污染。 3.1.2 市售薄层板
5、临用前一般应在 110活化 30min。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片 薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的层板底边的硅胶层不得有破损，如在储放期间 被空气中杂质污染，使用前可用适宜的溶剂在展开容器中上行展开预洗，110活化后，置 干燥器中备用。 3.2 点样 除另有规定外，在洁净干燥的环境下，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，应能使点样位置正确、集中。点样基线距底边 2.0cm（高效薄层板一般为 0.81.0cm） ，样点直径为 24mm（高效薄层板为 12mm） ，点间距离可视斑点扩散情况以 不影响检出为宜，一般为 1.02.0cm（高效薄层板可不小于 5mm） 。点样时必须注意勿损伤 薄
6、层板表面。 3.3 展开 展开缸如需预先用展开剂饱和可避免边缘效应。如需预饱和，可在缸中加 入足够量的展开剂，必要时在壁上贴两条与缸一样高的宽滤纸条，一端浸人展开剂中，密 封顶盖，一般保持 1530min，使系统平衡或按品种规定操作。 将点好供试品的薄层板迅速放人展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底 边 0.51.0cm（切勿将样点浸入展开剂中） ，密封顶盖，待展开至适宜的距离（如 20cm 长 的薄层板，展距一般为 1015cm，高效薄层板展距一般为 5cm 左右） ，取出薄层板，晾干， 按各品种项下的规定检测。 展开可以向一个方向进行，即单向展开；也可以进行双向展开，即先向一个方
7、向展开， 取出，待展开剂完全挥发后，将薄层板转动 90，再用原展开剂或另一种展开剂进行展开； 亦可多次展开。 3.4 显色与检视 荧光薄层板可用荧光淬灭法；普通薄层板，有色物质可在日光下直 接检视；无色物质可用物理或化学方法检视。物理方法是检出斑点的荧光颜色及强度；化 学方法一般用化学试剂显色后，立即覆盖同样大小的玻璃板，检视。 4 系统适用性试验系统适用性试验 按各品种项下要求对检测方法进行系统适用性试验，检测灵敏度、比移值（Rf）和分 离效能，应符合规定。 4.1 检测灵敏度 系指杂质检查时，供试品溶液中被测物质能被检出的最低量。一般 采用对照溶液稀释若干倍的溶液与供试品溶液和对照溶液在规
8、定的色谱条件下，在同一块 薄层板上点样、展开、检视，前者应显示清晰的斑点。 4.2 比移值（Rf）系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的 比值。按下式计算（Rf）=从基线至展开斑点中心的距离 从基线至展开剂前沿的距离鉴别时，可用供试品溶液主斑点与对照品溶液主斑点的比移值进行比较，或用比移值 来说明主斑点或杂质斑点的位置。 除另有规定外，比移值（Rf）应在 0.20.8 之间。 4.3 分离效能 鉴别时，将对照品与结构相似的药物对照品制成混合对照溶液，按规 定方法展开后，应显示两个清晰分离的斑点。杂质检查时，考察分离效能：可将杂质对照 品用自身稀释对照品溶液溶解制成混合对照溶
9、液；也可将杂质对照品用待测组分的对照品 溶液溶解制成很合对照溶液；或者采用供试品以适当的降解方法获得的溶液。上述溶液点 样展开后的色谱图中，应显示清晰分离的斑点。 5 测定法测定法 5.1 鉴别 可采用与同浓度的对照品溶液，在同一块薄层板上点样、展开与检视，供 试品溶液所显主斑点的位置（或荧光）与位置（Rf）应与对照品溶液的主斑点一致，而且 主斑点的大小与颜色的深浅也应大致相同。或采用供试品溶液与对照品溶液等体积混合， 应显示单一、紧密的斑点；或选用与供试品化学结构相似的药物对照品与供试液的主斑点 比较，两者 Rf值应不同；或将上述两种溶液等体积混合，应显示两个清晰分离的斑点。 5.2 杂质检
10、查 可采用杂质对照品法、供试品溶液的自身稀释对照法或杂质对照品法 与供试品溶液自身稀释对照法并用。供试品溶液除主斑点外的其他斑点应与相应的对照品 溶液或系列对照品溶液的主斑点比较，或与供试品溶液的自身稀释对照溶液或系列自身稀释对照溶液的主斑点比较，不得更深。 通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量，当采用系列自身稀释对照溶液时，也可规定 估计的杂质总量。 6 注意事项 6.1 薄层板的活化与保存 自制薄层板和市售薄层板在使用前均应进行活化，活化后 的薄层板应立即置于有干燥剂的干燥器中保存，保存时间不宜过长，最好随用随制，放入 干燥箱中保存仅作为使用前的一种过渡。 6.2 供试液的制备 溶剂选择是否
11、适当影响点样原点及分离后斑点的形状，一般应选 择极性小的溶剂；只有在供试品极性较大，薄层板的活性较大时，才选择极性大的溶剂。 除特殊情况外，试液的浓度要适宜，最好控制在使点样量不超过 10l（高效薄层板点样量 不超过 5l） 。 6.3 点样 薄层板上样品容积的负荷量极为有限，普通薄层板的点样量最好在 10l 以下，高效薄层板在 5l 以下。点样量过多可造成原点“超载” ，展开剂产生绕行现象， 使斑点拖尾。点样速度要快，在空气中点样以不超过 10min 为宜，以减少薄层板和大气的 平衡时间。点样时必须注意勿损坏薄层表面。待溶剂挥散后方可展开。 6.4 点样环境 实验环境的相对湿度和温度对薄层分离效果有着较大的影响（实验室 一般要求相对湿度在 65%以下为宜） ，因此应保持试验环境的相对恒定。对温、湿度敏感 的品种必须按品种项下的规定，严格控制实验环境的温、湿度。起草人：贾艺琦 唐素芳（天津市药品检验所） 复核人：高立勤（天津市药品检验所）
