微流控 生命科学研究应用

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1、微流控芯片技术在生命科学研究中的应用!王立凯冯喜增!（南开大学生物活性材料教育部重点实验室天津 !“#$）摘要微流控芯片最初起源于分析化学领域， 是一种采用精细加工技术， 在数平方厘米的基片， 制作出微通道网络结构及其它功能单元， 以实现集微量样品制备、 进样、 反应、 分离及检测于一体的快速、 高效、 低耗的微型分析实验装置。随着微电子及微机械制作技术的不断进步， 近年来微流控芯片技术发展迅猛， 并开始在化学、 生命科学及医学器件等领域发挥重要作用。本文首先简单介绍了微流控芯片制作材料和工艺， 然后主要阐述了其在蛋白质分离、 免疫分析、 %9:5 997?;3 A7;3:7BC，ADC;:5

2、 99D，5，17DJD !“#$，K2D7）480,$1#,A?:9F? ?2L ;3?2D9B9M5 9:MD7;3F ?7B ?23NC;:5，7F9L;C N?:9?7;9D ;3?2D9B9M3C ;9N7H3 N?:9?27DD3BC 9D 7 ?2L 789G; C33:7B COG7:3 ?3D;N3;3:CP 123 ;3?2D9B9M5 ?7D D;3M:7;3 ;23 C7NLB3QC DJ3?;9D，C3L7:7;9D 7DF F3;3?;9D D;9 7 CDMB3 ?2LP 123 7F7D;7M3 9?:9F?C C :7LF，2M2 3?3D?5 7DF B9R

3、 ?9DCGNL;9DPS;2 ;23 L:9M:3CC 9?:93B3?;:9D?C 7DF 9;23: N?:9?7;9D ;3?2DOG3C，;23 ;3?2D9B9M5 9?:9F? ?2L F33B9L3F:7LFB5 :3?3D; 537:C，7DF 83M7D ;9 LB75 N9:3 7DF N9:3 NL9:;7D; :9B3C D ?23NC;:5，89B9M5 7DF N3F?7B DC;:GN3D;CP12C 7:;?B3 D;:9FG?3F ;23 N7;3:7BC 7DF ;3?2DOG3C 9DM 7 N?:9F? ?2L DB5 3TL9GDF3F;C 7LLB

4、?7;9DC D L:9;3D C3L7:7;9D 7DF 7D7B5CC，NNGD97CC75，%3?;9D，7DF ?3BB ?GB;G:3 7DFF3;3?;9DP9+: -%$)0N?:9F? ?2L；NNGD97CC75；%G:3收稿：+“0 年 0 月，收修改稿：+“0 年 . 月!天津市科技发展基金应用基础重点基金和南开大学回国留学人员启动基金 （“$*00） 资助!通讯联系人3-N7B： TUP3FGP?D一、引言分析技术的进步极大地推动了生命科学的发展， 同时也提出了许多新的问题。随着多种生物基因组测序的完成， 特别是人类基因组计划 （WXY） 的完成将我们带入了后基因组时代

5、， 分子生物学已经进入蛋白质组学的研究阶段。仅仅从 %:?） 等。键合是微流控芯片加工中一个关键 的工艺环节， 一般可分为直接键合、 静电键合、 热键合和粘接等方法， 不同的材料， 其制作方法也有所不同。（)） 硅及玻璃芯片的制作硅或玻璃芯片微通道的制作分为膜的沉积、 光刻 （:575897:5;:?） 、 蚀刻和键合等 / 步。膜的沉积就是在基体的表面喷一层膜， 许多金属、 有机物、高分子聚合物等都可以沉积在硅或玻璃表面。光刻就是将掩膜 （+=4A） 上的图像转移到光敏物质膜上（光敏物质内包着硅或玻璃） 。光刻大于 )!+ 的图像用可见光， 小于 )!+ 结构可用紫外、 B 射线或电子束印刷

6、技术。键合是微流控芯片加工中一个关键的工艺环节。对于硅与玻璃一般采用静电键合， 该方法应用于一个绝缘表面和一个导电表面之间的键合。静电键合对两键合表面的光洁程度要求略低， 且键合力强。此时硅接正极，玻璃接负极，加热到 /0C， 电压约为) D。对于玻璃与玻璃， 多采用 热键合或静电键合。热键合就是将玻璃或硅加热到一定温度， 使两基片之间的表面粘接在一起， 然后冷却。亲水键合属于直接键合的一类， 是指在键合前先对两键合表面进行亲水处理， 然后把两表面在室温下直接贴合或加压贴合， 并在高温下 （) C左右） 进行退火处理。这种键合对两表面的光洁程度要求较高， 目前只适用于硅E硅面间的键合。（6;7

7、.18;.6= 6573?8A3 48;37，8=:（,）739A.18 46A:.=/ 65 !“#$4.1765A?.:.1 芯片， 即在固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵， 可特异地捕获样品中的靶蛋白， 然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析； 另一种就是微流控电泳芯片，通过在玻璃片或硅片上设置各种微泵、 微阀、 微电泳以及微流路， 可将生化实验室的分析功能浓缩固化在蛋白质芯片上， 然后在电场作用下， 样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来， 经喷雾直接进入质谱仪中进行检测， 以确定样品中蛋白质的分子量及种类。5?60, 等%8开发了由玻璃片为基底制作的微流体电泳芯片， 芯片大小

8、#A+, B #A+,， 采用光刻技术对所设计的流路进行刻蚀， 在微通道里加入待测样品和检测试剂， 电渗流泵首先用于样品的输送以及与反应试剂的混合， 反应后的溶液进入芯片上的电泳分离通道。为了满足高通量分析的需要， 可以在芯片上并行制作许多电泳通道结构。尽管微流体式芯片仍处在研制阶段， 但其潜在优势十分明显：（!） 由于微流体芯片中蛋白质吸附表面增大， 分析敏感度高；（%） 微通道可提高电泳分离的速度， 减少检测所需时间；（$） 微流体芯片耗样少、 成本低， 可重复多次使用。5?6.等人%9/;9 738?9A :7 9./: 7/ =9 :68B?;9 7B ? C89/9 !98. A.:

9、=98/9A .= =9 D“ :?-9A ./ *蛋白质芯片将为生物化学和分子生物学提供强有力的分析工具。相对于 “E* 芯片， 蛋白质芯片的研究进展显得相对滞后， 主要原因是2F：（0） 芯片材料表面的修饰方法尚不成熟；（2） 样品制备和标记操作过于繁琐；（D） 信号检测灵敏度低， 如低拷贝蛋白质的检测和难溶蛋白的检测精度更加难以保证， 因此需要研制和开发高度集成化样品制备及检测仪器。这些问题不仅为蛋白质芯片技术增加了难度，同时也是蛋白质芯片能否从实验室推向临床应用的关键所在2G。最近， (59-9/: 等人2H又制作出一种具有螺旋形通道网络的微流控芯片， 可使微管 （-.;876I659

10、） 沿着覆盖有驱动蛋白 （J./9:./） 的螺旋轨道运动并对其进行实时监测和浓缩， 称之为动力蛋白 “绕行” 。在细胞中， 动力蛋白在物质运输及细胞组分构建等方面起着十分关键的作用。活性生物运输分子如驱动蛋白不仅被用在细胞体系中运输纳米尺度的物质颗粒， 而且还可用于组装及定位细胞结构， 它利用 *! 水解所释放的能量沿着微管向其正极运输小泡。因此， 掌握并控制这些动力蛋白的运动情况对于构建生物纳米材料是十分重要的。(59-9/:等在微通道上覆盖了一层驱动蛋白， 并在蛋白溶液中加入 *!， 因此用荧光标记的微管可在驱动蛋白的作用下， 利用 *! 水解所释放出的能量沿着轨道滑行2K， D1。由于

11、控制动力蛋白的运动十分关键， 因此必须设计出最为适合的轨道D0。他们首先设计了 D 种不同形状的通道网络即十字交叉形、 三角交叉形以及螺旋形。结果表明， 微管在前两种轨道中运动时会陷于拐角处而无法持续前行； 而在螺旋形轨道中， 微管能够一直沿着通道运动并最终浓缩聚集于螺旋中央。如图 D 所示：（*） 和 （)） 是螺旋形微通道及其横截面的电镜扫描图；（(） 是不同时间内微管在螺旋形轨道中向螺旋中心运动的情况的荧光图；（“） 表明绝大多数微管聚集于螺旋中心， 只有极少数逃逸出去；（L） 显示 D1-./ 后逃逸的微管复返， 继续绕着轨道环行并向螺旋中心聚集。图 D （*） 螺旋形微流控通道及其横

12、截面 （)） 的电镜扫描图像；（(）和（L） 为微管在螺旋形通道中的荧光照片；（“） 绝大多数微管在螺旋中心凝集， 只有少数向外逃逸2H%.34D$;?/./3 959;87/ -.;8738?=9 :98/ （*）?/A ;87:M:9;.7/ 7B =9 ;=?/95 （)） ； %56789:;9/ .-?39:7B -.;876I659: ./ :8?;J:（(）?/A（L） ；（“）#.;876I659: -7: 7B9/ 89;.8;65?9A ./ =9 ;7/;9/M8?78， 7/5C 8?895C 9:;?;?的初始活力。酶活力之所以有如此大的浮动， 可能源于所加酶溶液的体

13、积不一致 （. A B.(C） 。他们还比较了在其他条件相同的情况下， 圆柱形与方形储存室对酶活力的影响， 结果表明， 用圆柱形储存室时酶活力较高， 并且释放平稳， 效果较佳。图 -!制作了在同一微片上进行两种不同分析的装置， 这种装置具有交叉式的结构， 进样体积只需 ,C。他们采用荧光标记的 8OK 对小鼠腹水中的抗 8OK 抗体进行直接检测， 线性范围 !2LFC。检测在很长时间内都可以保持很好的重现性， 并且在腹水中存在的高浓度的蛋白背景对检测没有明显的影响。8+$()*+ 等1P采用注射荧光素的手段对芯片电泳系统的电渗流进行了详尽的研究， 并且建立了数学模型。N*6(2 等-建立了一种

14、芯片上同时存在多个分B;-第 ! 期王立凯等微流控芯片技术在生命科学研究中的应用析通道的亲和毛细管电泳装置， 可以用来同时对多种体系进行分离分析。现在已经能在微流控芯片中通过荧光检测到单个的分子， 然而， 在微流控体系中进行免疫分析仍有一些缺陷， 如对一些复杂的未进行预处理的样品很难进行分析， 荧光检测无法进行放大处理等。因此，为了克服上述局限， 必须增加样品量或提高其浓度。扩散免疫分析是在一个 ! 形传感器中进行免疫分析， 这也是对微流控装置的一大革新。该体系是基于小分子 （抗原） 的扩散率大于大分子 （抗体） 的扩散率的原理而设计的， 免疫反应是在一个 ! 形毛细管网络的通道中进行的。两种

15、不同的溶液分别由 !形管道的两端流入， 在主干道相遇并形成层流。两种溶液分别由扩散率较高的小分子抗原和扩散率较低的大分子 （或微滴） 抗体所组成。由于抗原分子扩散得比抗体快， 它们将在两种液流的接触表面被抗体所捕获， 因此在两溶液的接触表面形成一个浓度梯度， 该梯度不但可以测量， 并且通过计算能够表征抗原的浓度， 如图 “ 所示#，#$。图 “ （%） !57 3./ )53/67)2214/ 6/4?154/ -!12%(+8 /0!,1658 (8?:/+5- 1$1(28+ +95 7/2752+61+(/2 /0 +95 12+(4$,(251 ?($#$%8)95-1895-:(25

16、(2-(71+58+95;518,65-317A$6/,2- 0:,/65875275取决于它的来源物种。图 B 的!?:4A 等:?/:4/: GK:;N 67(DEF 5MA?5M:$?= 在芯片微柱间穿行时的荧光照片；（） 微柱间不同的区域即 *08 区和 280,.区； 图 （A） 为!$?= 在对应区域内的迁移速度()*+!$?= 43 -. #$%.2 2-4: /),948);092； （A）7-. *908-2-4:2 -. 28.1 45 $?= /4;.,C;. ,0;,C;0.1 594/ -.0,- 842)43 )3 .6.9D 6)1.4 590/.状结构， $?= 分子在通道内泳动