蛋白质组学_百替生物

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1、 第 章 蛋白质组学 第一节 蛋白质组学的产生背景 人类基因组计划已经告一段落， 对人类基因组的测序工作已经完成。 基因组学取得的 成果是非常令人振奋的， 但是也随之产生了新问题。 大量涌出的新基因数据迫使我们不 得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。 不仅如此, 在细胞合成蛋白质之 后, 这些蛋白质往往还要经历翻译后的加工修饰。 也就是说, 一个基因对应的不是一种蛋 白质而可能是几种甚至是数十种。 包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？ 或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、 如何相互作用、 相互协调的？这些问题远不是基 因组研究所能回答得了的。 正是在此背景下, 蛋白质

2、组学(proteomics)应运而生。 蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯(Marc Wilkins)最先提出来的, 最早见诸于 1995 年 7 月的“Electrophoresis”杂志上, 它是指一个有机体在特定时期的全部蛋白质组成 及其活动方式。 蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段, 但已经取得了一些重要进展。 当前 蛋白质组学的主要内容是, 在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时, 进行蛋白质组 分析。 对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。 一方面, 通过二维凝胶电泳得到正常生 理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱, 相关数据将作为待检测机体、组织或 细胞的二维参

3、考图谱和数据库。 一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通 过互联网检索。 二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。 蛋白质组 分析的另一方面, 是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。 如蛋白质 表达量的变化, 翻译后修饰的变化, 或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位 的改变等。为此，需要借助一些高通量、快速、准确、自动化程度高的技术和手段对研究 对象进行处理，如激光显微切割技术、双色红外荧光检测技术、高通量全自动蛋白纯化及 分析系统以及蛋白芯片技术等。 细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物, 蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞 进行一切代谢活动

4、的基础。 蛋白质间的相互作用及作用方式同样也是蛋白质组研究所面 临的问题。 研究蛋白质间的相互作用有多种方法, 常用的如酵母双杂交系统、亲和层析、 免疫沉淀、蛋白质交联等。 其中, 酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用广泛的主要方 法。 第二节 蛋白质组学及研究技术路线 2.1 蛋白质组蛋白质组学的研究内容学的研究内容 1）蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合 Western blot 等技术，利用蛋白 质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。 2） 翻译后修饰： 很多 mRNA 表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化， 糖基化， 酶原激活等。 翻译后修饰是蛋白质调节功

5、能的重要方式， 因此对蛋白质翻译后修饰的研究 对阐明蛋白质的功能具有重要作用。 3）蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体 结合分析。可以利用基因敲除和反义技术以及干扰 RNA 技术分析基因表达产物-蛋白质 的功能。 另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能 的了解。Clontech 的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。 4）对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学 的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白 质。药物也可以干预蛋白质-蛋

6、白质相互作用。 在基础医学和疾病机理研究中，了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及 不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。 这些研究可能找到直接与特定生理 或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。 2.2 蛋白质组学研究技术路线蛋白质组学研究技术路线 不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的， 因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。 可以利用免疫组织化学技术达 到这个目的，但该技术的致命缺点是通量低。LCM 技术可以精确地从组织切片中取出研 究者感兴趣的细胞类型，因此 LCM 技术实际上是一种原位技术。取

7、出的细胞用于蛋白质 样品的制备，结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线，可以对蛋白质的表达进行原位 的高通量的研究。 很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线， 其研究结论值得怀 疑， 因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起， 最后得到的研究数据根本无法解 释蛋白质在每类细胞中的表达情况。 虽然培养细胞可以得到单一类型细胞， 但体外培养的 细胞很难模拟体内细胞的环境，因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。 因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离， 分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达 研究，包括 mRNA 和蛋白质的表达。 LCM 技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备

8、。可以根据需要制备总蛋白，或膜 蛋白， 或核蛋白等， 也可以富集糖蛋白， 或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。 蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。 二维电泳可以将不同种类 的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将 2000 到 3000 种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比 较两种样品之间蛋白质表达的异同， 可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品， 然后 在同样条件下进行二维电泳， 染色后比较两块胶。 也可以将二者的蛋白质样品分别用不同 的荧光染料标记， 然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的

9、分离， 最后通过荧光扫 描技术分析结果。 胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像， 然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分 析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点 所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/ 浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面 （MALDI-TOF） 。 最后 这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用 于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。实际上像人类的血浆，尿液，脑脊液，乳 腺， 心脏， 膀胱癌和鳞状细胞癌及多种病原微生物的蛋白质样品的二维

10、电泳数据库已经建 立起来，读者可以登录 www.expasy.ch/www/tools.html 等网站进行查询。 LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以 外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即通过 LCM 技术获得 感兴趣的细胞类型，制备细胞蛋白质样品，蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交，从 而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。 一张抗体芯片可以对近 400 种膜蛋白和胞浆蛋白 进行分析。 对于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。 Clontech 开发的酵母双杂交系统和 NEB 公司开发的噬菌

11、体展示技术可供研究者选用。 关于蛋白质组的研究， 也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯 片， 这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究， 蛋白表达研究和小分子蛋白结合研 究。 最后有必要指出的是， 传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质， 而蛋白质组学注重研 究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白 质组学的研究通常是高通量的。 适应这个要求， 蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自 动化的系统，通量高而速度快，配合相应分析软件和数据库，研究者可以在最短的时间内 处理最多的数据。 图一 蛋白组学流程图 第三节 蛋白组学常用技术 3.1 L

12、CM-双向电泳质谱双向电泳质谱 一、激光俘获显微切割技术一、激光俘获显微切割技术 蛋白组学分析的对象是特定组织细胞在特定时间的蛋白表达，因此从组织中分离出单 一细胞群就显得非常重要。 常规的显微镜下手工分离不可避免会有其他细胞混杂， 经典的 细胞培养虽可以得到单一细胞群， 但体外培养的细胞和在体细胞必定有差异， 因此不能完 美的建立细胞模型。 LCM 即激光俘获显微切割技术（laser capture microdissection） ，其过程可概括如下： 首先在组织切片上覆盖一层透明的膜， 在显微镜下观察该组织切片， 选择某一特殊细胞后， 开启脉冲式红外激光束，使膜融化变得粘性很强(该膜的成

13、份为 Ethylene Vinyl Acetate Polymer)，等到冷却后将该位置的细胞牢固地粘附在上面从而分离细胞。 该种方法较以往方法改进之处：首先，它简单，不需要移动任何切片部位，一步即 可完成从组织中分离特殊细胞，这些在膜上的细胞依然保持其原有的形态，使用无菌、一 次性的膜可最大限度地避免可能的污染。其次，使膜活化所需的激光能量很小(50mW)， 与常规显微配合是充足的，完全能够满足临床病理组织细胞显微分离的需要。再者，LCM 技术分离细胞速度较以往方法有很大提高，例如，从肾组织切片中分离一个肾小球 (Glomerulus)所需时间小于 10 秒，一小时内即可轻松地分离上百个

14、肾小球。手工分离方法 远远不能达到该速度。 由于组织切片固定， 操作者可以反过来确定所分离的细胞是不是正 确的靶细胞，而手工机械显微分离可能会引起周围其它细胞一块松动，污染靶细胞。 得到目的细胞后就可以从细胞中提取总蛋白进行分析，但是由于最灵敏的双向电泳 也只能区分 20003000 种蛋白，所以在蛋白提取过程中可以分类制备，如分别提取膜蛋 白、胞浆蛋白、核蛋白、骨架蛋白、线粒体蛋白、内质网蛋白等，也可以根据蛋白溶解性 分别制备最可溶、中等可溶、不可溶、高度不可溶和最不可溶蛋白。 二、双向电泳二、双向电泳 双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)是分析从细胞、

15、 组织或其它生物样品中提取 出来的蛋白混合物最有力和广泛应用的方法。 这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤 中的特性将蛋白质分开：第一向步骤等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（pI）将 蛋白质分离。在第二向步骤中 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）利用蛋白质的 分子量（Mr, 相对分子量）大小将它们分离。双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品 中的单一蛋白。因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量 和含量的信息都能得到。 概括起来，双向电泳的实验步骤为: 1、样品的制备 2、IPG 干胶条的再水化 3、等电聚焦电泳（IEF） 4、IPG 胶条平衡 5、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 6、染色 7、结果分析 双向电泳从样品制备开始。正确的样品制备方法对得到好的双向电泳结果相当重 要。双向电泳下一个步骤是 IPG 干胶条的再水化。购得的 IPG 胶条是干制的，在等电 聚焦（IEF）之前必须将 IPG 干胶条在含有合适的试剂的溶液中进行水化。第一向等电 聚焦是在有温度控制和高电压的条件下的平板电泳仪上进行。接下来，为了进行第二向 的分离，IPG 胶条在含有 SDS 的缓冲液中进行平衡。平衡后，将 IPG 胶条放在第二向 凝胶上进行电泳。最后的步骤是进行染色及对双向电泳点阵结果进行分析。 （一）样品制备（一）样品制备 样品制