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1、华中科技大学硕士学位论文4-苯并芘、砷）等。肺癌的发生发展的机理和作用机制目前深入到基因水平，有关肺癌的致癌基因和抑癌基因的研究，目前已积累了相当多的资料。一般认为基因的异常改变是癌变的基础，英国癌症研究院的科学家通过大量的 DNA 样本分析，共确定出64 个基因变异体可能使一些个体容易患肺癌，这 64 个 SNP 中的一部分能改变被表达蛋白的结构和功能，可能与肺癌有直接关系。已经证明在肺中有几个癌基因家族表达异常，包括引起突变的 ras 家族，放大基因的 myc 家族、c-erbB，与凋亡相关的 bcl-2、kit 以及变异的野生型抑癌基因 p53、p16 和 RB 等。大量的实验和临床研究
2、证明在NSCLC 中常见 ras 族基因产物、c-erbB-1/2、VEGF/VEGFR 及 EGFR 等的过度表达和野生型 P53 基因的缺失。自 20 世纪 70 年代，FolkmanJ 教授提出肿瘤生长与血管化以来，大量的研究证实，实体肿瘤的生长、侵袭、转移等生物学行为与肿瘤内新生血管的生成重塑等相关。因此抑制肿瘤血管生长一直是肿瘤治疗的一个热门方向。VEGF/VEGFR 作为目前已知最强的促肿瘤血管生成因子，对肿瘤血管的生成和肿瘤的生长起着关键性的作用。最新的研究发现 VEGFR2 与肿瘤的转移和归巢有着密切的关系。虽然在临床上以VEGF 及其受体为靶点的生物治疗已在进行，如美国 FD
3、A 已批准上市的 VEGF 的单抗 AVASTIN，尚在进行临床试验的 VEGF 受体拮抗剂 PTK787/ZK222584 等，但是对于细胞内 VEGF 转录及表达的信号传导通路之间仍然了解的不是很多。调控 VEGF 的信号通路有多种，如 PI3K/Ak-m TOR，Ras-Raf-MEK/MRK，e NOS/NO，IP3/Ca 2+等，而且相互之间也存在着联系，彼此互相连通，构成信号网络。本实验研究的信号通路是 PI3K/Akt-mTOR。已有的研究证实，PI3K/Akt 信号通路可以调节细胞的多种生物功能生存，包括细胞的生长，凋亡，迁移，侵袭 ，在对 VEGF 转录及表达的调控中起着重要
4、作用。本实验希望证实通过对 PI3K/Akt 信号通路某一个节点的抑制能降低VEGF 的转录和表达 。2华中科技大学硕士学位论文论文正文肺癌作为肿瘤一类疾病中的多发病，常见病，高危病，发病率和死亡率在全世界和 我 国 都 是 占 第 一 位 的 。 而 在 肺 癌 中 ， 非 小 细 胞 肺 癌 （ non-small cell lungcancer ,NSCLC）占到 75%80%左右。恶性实体肿瘤在生长和转移中，血管发生起着至关重要的重用。Folkman J 早在 70 年代就提出了肿瘤生长与血管新生的关系，认为血管生成将是肿瘤研究治疗的一个新的领域。已有的研究证实，VEGF 作为迄今为止
5、发现的最强的促血管生成因子，在 NSCLC 的发生发展过程中起着非常重要的作用。但是对其在细胞中转录和调控的信号通路不是很明确。本实验旨在通过研究PI3K/AKT 抑制剂（LY294002）对肺腺癌细胞株 A549 的 VEGF 在转录和蛋白表达水平的调控作用，从而从一个侧面观察 VEGF 在 NSCLC 发展过程中的作用。1材料1.1 细胞人肺腺癌细胞系 A549 购自武汉大学培养物保藏中心1.2 引物人 VEGF 引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：正义链 5ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG3反义链 5TCACCGCCTCGGCTTGTCACATC 3 扩增产物片断长为
6、576 个 bp 。内参 GAPDH 是 invitrogen 公司合成，序列正义链 5GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3反义链5GAAGATGGTGATGGGATTTC3 扩增产物片断为 226 个 bp。冻干粉用无菌三蒸水溶解,使其储存浓度为 25mol/L, - 20储存备用。1.3 主要药品和试剂RPMI 1640 培养基、新生小牛血清(均为 GIBCO 公司，USA)；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶（均为 Sigma 公司，USA)； TRIZol reagent (Invitrogen公司，USA)； Oligo dT、M-MLV 逆转录酶（均为 Promega 公司，US
7、A）；5（华中科技大学硕士学位论文dNTPs、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子量标准（均为清华天为公司）；VEGFELISA 试剂盒（孔，购自晶美公司）；琼脂糖（Espain 公司）；LY294002（购自晶美公司）；其他试剂为国产分析纯。1.4 主要仪器与器材PCR 扩增仪（UNO型，Biometre 公司，USA）；超净工作台（YJ-1450） 江苏苏州净化设备公司）；二氧化碳培养箱（Shellab 公司，USA）；低温高速离心机（Beckman 公司，USA）；低温台式离心机（Sigma 公司，USA）；可见-紫外分光光度计（U-2000，Hitachi 公司，Japan）；核酸电泳
8、仪(北京六一公司)；电子天平（十万分之一，AB250G 型） 丹法仪器公司，USA）；酶标仪（Elx800）（Bio-TEK Instruments）；6 孔培养板、24 孔培养板、96 孔培养板（Falcon 公司，USA）。2方法2.1细胞培养A549 细胞生长于含有 10%新生小牛血清的 RPMI 1640 培养基（含 100 u/ml 青霉素和 100 mg/L 链霉素，pH 值调至 7.2-7.4）中，37 ，5%CO2 培养箱中常规孵育，每 2-3 天换液传代，分瓶传代继续培养。取对数生长期的细胞用于实验。待细胞处于生长对数期时，将其种植到 6 孔板中，每孔种植约 2*106 个细
9、胞。2.2 实验干预在种植好细胞的孔板中，分别加入 PBS（阴性对照），DMSO，一定浓度（10uM，20uM，50uM，100uM）的 LY294002，在孵箱中培养 24h，然后收集孔板中的细胞和培养液待用。2.3 RT-PCR 法检测VEGF mRNA 表达（1）A549细胞总RNA的提取及鉴定按Trizol Reagent 操作指南提取细胞总RNA。6华中科技大学硕士学位论文1） 每10cm2培养板面积加入Trizol Reagent 1 ml，室温下静置30min裂解细胞，将充分混匀的细胞裂解也转移入DEPC.H2O处理过的Ep管中（所有Tip头和Ep管均经DEPC.H2O充分浸泡，
10、高压后备用）。2）加入氯仿（0.2ml/mlTrizol，提RNA专用）抽提，剧烈震荡15s后，室温放置5min，于4，12000g离心15min后，样品分层，取上层水相（约同加入氯仿的体积）于另一Ep管中。3）加异丙醇（0.5ml/mlTrizol，提RNA专用），-20沉淀2小时或过夜，于4，12000g离心15min，可见白色沉淀附于管底或管侧壁。4）弃上清，加75%乙醇（1ml/mlTrizol,提RNA专用无水乙醇，DEPC.H2O稀释）洗涤沉淀，4，7500g离心5min后，弃上清，沉淀在室温下干燥后以适量DEPC处理的三蒸水溶解。5）取2lRNA水溶液，以DEPC处理的三蒸水稀释
11、至500l。用紫外分光光度计比色测定OD260nm和OD280nm值，以OD260nm/OD280nm 比值估算RNA纯度。RNA的浓度计算公式为：RNA的浓度（g/l）=OD260nm稀释倍数40/1000（2）逆转录反应1）另取新的Ep管，加入4g总RNA、Oligo dT 1l，DEPC处理的三蒸水补充体积至16l，混匀后短暂离心。2）70水浴5min后，迅速置于冰上冷却1min以上。3）加入5逆转录反应buffer 5l、10mM dNTPs 3l、200u/l M-MLV逆转录酶1l（总体积25l）。混匀，短暂离心，42恒温60min进行反应。4）85加热5min灭活逆转录酶。逆转录
12、产物置于-20保存备用。（3）PCR 扩增反应取1l逆转录产物为模版进行PCR 扩增。PCR反应体系（25l）：7华中科技大学硕士学位论文去离子水10TaqDNA聚合酶反应buffer25mM MgCl2 溶液上游引物溶液（25M）下游引物溶液（25M）TaqDNA聚合酶10mM dNTPs逆转录产物16.5l2.5l1.5l1.0l1.0l1.0l0.5l1.0lVEGF 的PCR反应条件：94 孵育5min， 94 变性30sec，56 复性30sec，72延伸1min；35个循环后末次循环72延伸10min,。GAPDH扩增的反应条件是 94 ,5 min 预变性;94 ,30 s ,5
13、5 ,30 s ,72 ,1 min ,35个循环后72延伸10 min。（4）PCR产物电泳取5ulPCR产物加入1ul的6*Loading Buffer，进行2%琼脂糖凝胶电泳（含0.5g/ml的EB），电泳缓冲液为1TAE，在50V电压下电泳30min，紫外灯下观察结果。凝胶成像系统摄像并分析，以VEGF与GAPDH扩增条带的峰面积比值进行mRNA水平的相对定量。2.4VEGF 蛋白浓度的测定取处理过的六孔板的上清液，按照人 VEGF ELISA 试剂盒的说明，通过双抗体夹心 ELISA 法测定其中的 VEGF 蛋白的浓度。1） 分别将标本和不同浓度的标准品（100ul/孔）加入试剂盒所
14、提供的板条的相应孔中后，用封板胶纸封住反应孔，37孵育箱孵育 90min。留一空白孔作对照。2） 洗板：甩尽孔内液体，每孔加入洗涤液 350ul，静止 30sec 后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗 4 次。3） 除空白孔外，每孔加入生物素化抗体工作液（100ul），用封板胶纸封住反应孔，37孵育箱孵育 60min。8细胞数（/ml）华中科技大学硕士学位论文4） 洗板 4 次，方法同上。5） 除空白孔外，加入酶结合物工作液（100ul/孔），封住板孔，37孵育箱孵育 30min。6） 洗板 4 次，方法同上。7） 加入底物显色剂 100ul/孔，37避光孵育 1520min。8） 加入终止液
15、100ul/孔，混匀后即刻在酶标仪上测量 OD450（5min 内）。每个样品做双复孔，取平均值，重复 3 次。9） 结果判断：每个标准品和标本的 OD 值减去零孔的 OD 值，以标准品浓度作横坐标，OD 值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，绘制标准曲线。根据标准曲线得出样品浓度。2.5统计学方法所有实验结果均用( x s)表示，采用 SPSS11. 0 统计包进行统计分析；组间采用单因素方差分析；以 P0.05 为差异有显著性。3结果.肺腺癌 A549 细胞生长曲线（细胞计数法）如图一所示，呈无限细胞生长1.41E+061.21E+061.01E+068.05E+056.05E+054
16、.05E+052.05E+055.00E+030123 4 5678 时间（天）图一细胞生长曲线9（ （ （ （华中科技大学硕士学位论文图二 对数生长期 A549 细胞2.总 RNA 提取时，其纯度 R=OD260/ OD280 如下表一所示：LY294002PBSDMSO10uM20uM50uM100uMR（ x ）1.2321.2281.2081.2011.2161.205表一 提取 RNA 时 OD260/ OD280 平均比值3.电泳图谱如图二所示，作为阴性对照的 PBS 板转录出来的 VEGF 条带最亮，而其他含不同浓度的 LY294002 的条带相对较暗。VEGF mRNA 与内参 GAPDH 光密度比值分别为（0.4330.011）， 0.4160.007）， 0.3410.009）， 0.2980.01）， 0.2590.008），（0.1750.011）。其中阴性对照组与 DMSO 组
