《肌肉细胞特异性增强因子2A（MEF2A）在斑马鱼心脏和体节发育中的作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肌肉细胞特异性增强因子2A（MEF2A）在斑马鱼心脏和体节发育中的作用（175页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成粟。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名论文使用授权声明日期：丝生坦本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，& 口：学校有权保留送夏论文的复印件，允许论文被查阅和借阕；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名英文缩略词表A b b r e v i 拍岫英文缩写英文全称中文名称Aa 舡l 啪心房A S F粗i a
2、ls I I o 咖i l l g 丘枷。心房收缩指数 袖c砌a lI r 可。菇nh 戗I v yd I a i l l心房特异性肌球蛋白重链B mb o m 删) f p l l o g 朝甜cp t e i n骨形态蛋白b pb a p a i r碱基对肿d i m i o t l l r e i t o l二硫苏醇糖G F P掣啪n r 嚣咖t l 删n。 绿色荧光蛋白h p fh o u 陪p o s tf e 州i l i z a I i o n受精后小时口r r Gi s o p r 0 1 ) y l “o - p D - g a l a 曲i d e异丙基硫代附D - 半乳糖
3、苷K 匝F 2 AI I 黟o c y t e - 即e c 砸c 雠h a l l c 盯f h c t o r2 A肌肉细胞特异性增强因子2 AN 匝C Kn 珂o s i I l l i g h tc h a i l Il 【i n 蹴肌球蛋白轻链激酶M OI I r p h o l 讪。吗啡啉珉、，Cn 伽咀a t a lr 砒v e n 仃i c I l I 缸c a r d i o m y o q 懈新生大鼠心室心肌细胞P B Sp h 唧h g 伦b 佃硫ds a l i l I e磷酸缓冲盐溶液P C Rp o l y n l e 瑚ec h a i l l 磁枷聚合酶链式反应
4、P 弘3 Kp h o s p h o i s m d e3 一k m a 磷脂酰肌醇激酶3P L C 7 lp h o s p h o l i p a s e C 丫l磷脂酶C Y lS D Ss o d i 啪d o d e c y l s l l l f 如十二烷基磺酸钠S S Cs 伽捌s a l i n ec i t l a 协标准柠檬酸缓冲液1 A G Ep o l y a c r y l 枷d eg e le l e 咖p h o 嘴i s聚丙烯酰胺凝胶电泳t 印1 l i n a Id e o x y n l l c I t i d e 仃a 璐f b r a 删亭d i a
5、t e d末端脱氧核苷酸转移酶介导的 I U N E L d U n 血c k - dl a b d i n gd U I P 缺口末端标记Vv 州c I e心室v E G Fv 笛c l l l 缸饥d o t h e l i a l 掣o w I l lf 缸t o r血管内皮细胞生长因子v m h cw 枷c l l I 缸n 黟o s i I lh e 孙c h a i l l心室特异性肌球蛋白重链V S Fv 仃i c I I I 缸s l l o 咖i I l gf h c d o心室收缩指数X g a l5 勘D m 0 4 洲o r o 3 - i n d o l y l p
6、o 鲥a c 鼢i d e5 一溴4 氯3 吲噪- e - D - 半乳糖昔博士学位论文中文耍中文摘要肌肉细胞特异性增强因子2 基因( 岣阳叼抛掣批，l J l 册鲫，7 2 犯t D ，Z 扭砣)广泛存在于果蝇、斑马鱼、小鼠和人类中。在小鼠和人类中， 伍心基因家族至 少存在4 个成员：M 盱弘。舰嘲脱舒? c 和脱E F 2 D a 其中M 晒列在骨骼肌细胞的发育、分化过程中发挥着关键作用。人类家系遗传分析表明突变的舰酷2 4是冠状动脉粥样硬化的致病基因之一，这一致病基因的发现为研究冠心病的发病机理、开发预防和治疗相关的新药具有重要价值。分子遗传学筛查发现冠心病患者中近2 可能携带有彪醪弘突
7、变基因，这就提示必职崩基因突变与冠心病及心梗有直接相关性，肼断弘基因在冠心病发病过程中有重要功能，但具体机制尚不清楚。最近，上述结论引起争议。膨盱黝基因敲除小鼠出生后死于猝死，M 瞄以杂合性突变体小鼠出生后发育正常，M 醯功t4 小鼠死因不明。模式生物作为研究基因功能的一种新型的研究方法，斑马鱼胚胎透明、体外发育、个体小、繁殖率高、产卵时间长、以及鱼种发育遗传背景清晰等优点使其正成为研究脊椎动物发育生物学、发育遗传学的理想模式生物。斑马鱼属于脊椎动物，其心血管、血液、消化道、肝脏、肾脏以及视觉系统与人类相应系统有许多共同特点。用该模型阐明早期发育、器官形成、系统生理学、药理学和复杂疾病等问题均
8、切实可行。2 0 0 0 年，s e 、，i c i 啦等提出了注射吗啡啉修饰性寡核苷酸可获得基因下调斑马鱼。吗啡啉有抑制翻译的起始，减少传统反义寡核苷酸非特异性的效应。注射吗啡啉能够产生以往证实的基因突变的拟表型，有助于确定未知功能的基因。吗啡啉寡核苷酸正在成为快速、高效的基因敲除方法，使经典反向遗传学方法应用于斑马鱼。斑马鱼具有许多适合0 血管系统疾病研究的优势，斑马鱼的心脏容易观察和便于操作，更有意义的是，由于它的胚胎小，可以不依赖于有功能的心血管系统，甚至在整个心血管循环缺失的情况下，它仍然能通过对氧的被动运输而生存，继续发育一段时间，这就可以活体观察心血管系统有严重缺陷的突变体，为心
9、血管发育遗传学研究提供极为有利条件亡，此外，斑马鱼与人类的心脏发育具有极其相似的基因调控途径，因此进行斑马鱼的心脏发育机制研究，对揭示人类心脏发育的基因调控机理有重要的启示意义，这使得斑马鱼成为进行心脏发育生物学研究的重要模式动物之一，极大地推动心血管疾病发病机制的研究a应用斑马鱼正向遗传学( f o r 黼晡g 雠e t i 讳) 研究己鉴定了多个影响心脏收缩 功能的突变体。突变体w 础砷f 删心房停止跳动，而心室正常节律性收缩；酊 明f船州是心脏收缩功能缺陷最严重的突变体，其心房和心室都停止跳动，但心房 和心室外形发育正常；突变体g l 虎f 加舯心房和心室几乎停止跳动，但心房和心2博士学
10、位论文中文瓣要室外形发育正常：突变体曲髓觑毋0 房和心室跳动但无血液循环，胚胎发育到4 8小时时，纯合子突变体腑P 纠 P d 严重水肿，整个心脏形成针样结构。定位克隆结果证明上述突变基因是形成肌节的结构蛋白质的相应编码基因，心肌肌原纤维由粗、细肌丝规律排列组成，心肌肌节是心肌收缩的基本元件，肌丝的滑动是心肌收缩的动力基础。构成肌节的结构蛋白质突变可导致扩张型心肌病或肥厚型心肌病，甚至心力衰竭。到目前为止，在大规模斑马鱼遗传筛选中，还没有突变体的突变基因遗传定位到 征F 2 4 位点。B M P 2 是参与胚胎早期分化发育的又一个因子，有趣的是，发育后期机体 羽织2 基因仍有表达，提示8 僻2
11、 基因在发育后期仍有生物学功能，但蕊职瑾因敲除小鼠在早期胚胎7 o - l O 5 天时就死亡，妨碍了探讨鳓仍2 基因在发育后期的功能。到目前为止，还没有直接的遗传学证据表明础毋2 调节心脏收缩。本研究得 利于斑马鱼在心血管发育遗传学中的优势，醐俨撞I 因敲除小鼠在早期胚胎死亡，所以用小鼠模型研究发育后期醐毋2 基因功能很困难。相反，斑马鱼胚胎发育并不完全依赖有功能的心血管系统，环境中的氧可以扩散进入胚胎机体。这就 为探讨厕批2 基因功能提供可能。我们实验证明，心肌细胞可以合成并分泌B M P 2 ，矾皿2 不仅是背腹分化所必需的，也是维持心脏收缩所不可缺的。新生大鼠心肌细胞模型作为一种体外实
12、验研究模型，可以更方便地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发病机制，成为心血管疾病研究的一项主要手段和基本技术。体节发育过程受多种遗传因子调节，有趣的是斑马鱼前6 个体节每2 0 分钟形成1 个体节，而后2 4 个体节每3 0 分钟形成1 个体节。表明前部体节和后部体节发育机理不完全相同。斑马鱼大规模遗传筛选获 寻多个体节发育缺陷突变体，还没有突变体遗传定位到M 醪酬位点。第部分魁E F 扒在斑马鱼心脏发育中的作用本部分研究拟利用斑马鱼在心血管发育遗传学优势，探讨膨盱列基因在斑马鱼心脏发育中的作用。首先。利用R T P C R ，胚胎整体原位杂交和脱礤刎：G F P 转基因斑马鱼的动态分析等多种
13、手段探讨蛐盯2 A 在胚胎发育中的表达模式，表明M 砑以在斑马鱼胚胎发育过程中在心脏及体节中有表达，在心脏中的表达提示M 酷黝在心脏发育中有某种特定功能。博士学位论文中文摘要其后，利用吗啡啉修饰的寡核苷酸技术在整体水平下调( 1 m o c k 曲帅)膨盱翻基因的表达。探讨其异常表型及其机制。发现：1 胚胎发育到4 8 小时时，胚胎心脏形态发生正常。但心脏收缩频率降低。心室收缩指数降低，心肌收缩力降低，整体动物实验提示拟巨F M 参与心脏的收缩功能。2 心肌电镜结果提示肘匿F 豺参与心肌肌节的组装， 绝F z 4 功能下调导致心肌肌节的组装紊乱，细胞水平证明膨盱黝的功能完整是心脏正常收缩所必需
14、的。3 ，R e a l j n 嵋p C R 、原位免疫荧光实验技术显示脱砑刎的表达下调能导致参与心肌收缩基因的表达异常，这些收缩基因的表达产物收缩蛋白是形成心肌肌节的基本元件，是参与心肌收缩的动力装置。从分子水平证明M 晒勉参与心脏的收缩功能。第二部分姗作用于 伍砣d 上游调节心脏收缩第一部分我们提供了脱断黝调节心脏收缩的功能的遗传学基础，F 2 A作为一个转录因子，其上游的调节机制还很少有报道。本部分研究综合利用斑马鱼和心肌细胞模型，首先，分析了斑马鱼、大鼠和 人的B M P 2 和姬F 2 A 高度同源：其次，证明脚毋2 和膨晒黝在胚胎心脏中共同表达：再次，提供m 护2 调节心脏收缩的
15、遗传学证据；第四，用生化手段证明B M P - 2 可以调控新生大鼠心室心肌细胞M B F 2 A 的表达；第五，用功能恢复手段证明膨酷黝作用于丑 卵2 下游调节心脏收缩；第六，提出m 4 心圳砑2 ，哇通路调节心脏收缩的模型，分析靶向丑a 护孙组F z d 通路可以为心力衰竭的防治提供新的手段。第三部分膨踟- 2 4 在斑马鱼体节发育中的作用第一部分我们证明M 盱黝在斑马鱼胚胎发育过程中在体节中有表达，在体节中的表达提示脱盱以在体节发育中有某种特定功能。体节发育过程受多种遗传因子调节，有趣的是斑马鱼前6 个体节每2 0 分钟形成1 个，而后2 4 个体节每3 0 分钟形成1 个，表明前部体节
16、和后部体节发育机理不完全相同。斑马鱼大规模遗传筛选获得多个体节发育缺陷突变体，还没有突变体遗传定位到艇硒列位点。4博士学位论文中文箝要本部分研究利用斑马鱼在体外发育、胚胎透明、发育快速的特点，探讨M E 彤彳基因在斑马鱼在体节的作用。利用吗啡啉修饰的寡核苷酸技术在整体水平下调膨晒弘基因的表达，探讨体节发育缺陷表型其异常表型，发现1 斑马鱼胚胎配酷弘下调后尾部向下弯曲，形成U 型的后部体节：2 膨眈4 是胁啦 D g 通路所必需的，尽管比盱黝不影响蝴啪的表达：3 埘E F 列下调后导致后部体节凋亡增加：4 蜀卿 咖昭信号抑制 班泸2 ，董的表达：5 利用表达谱基因芯片技术探讨M E F 2 A 基因下调后的基因表达改变，为研究膨醯弦4 下游的靶基因提供的源泉。上述实验证明 z E F 2 1 4 是斑马鱼后部体节发育所必需的第四部分W o r 劬舢i n 诱导斑马鱼“双心畸形”本论文第一、二部分我们证明丑 织2 及M 醪黝调节心脏收缩的功能，等报道
