《人角质细胞生长因子2的基因克隆、表达、纯化及活性检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人角质细胞生长因子2的基因克隆、表达、纯化及活性检测（84页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、山东省医学科学院硕士学位论文主要符号表b p ( b a s ep a l 0碱基对B l o t ( r i n g )印迹D A B ( d i a m i n ob c n z i d i n e )二氨基联苯胺D E P C焦碳酸二乙酯d N T P ( d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e )脱氧核糖核苷三磷酸E B ( e t h i d i u mb r o m i d 0溴化乙锭E c o f i大肠杆菌F G F l 0成纤维细胞生长因子1 0G I T ( g u n i d i n ei
2、s o t h i o c y a n a t e )异硫氰酸胍k a n a卡那霉素k b ( k i l ob a s ep a i t )千碱基对K G F 2人角质细胞生长因子2m R N A ( m e s s e n g e rR N A )信使R N AM T T四甲基噻唑氮盐O D ( o p t i c a ld e n s i t y )光密度R N a s eR N A 酶r p m ( r o l lp e rm i n u t e )每分钟转速R T - P C R ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e
3、 r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 逆转录聚合酶链反应S D S ( S o d i u mD o d e c y lS u l f a t e )十二烷基磺酸钠 T E M E DN ，N ，N ，N - 四甲基乙烯二胺M C S ( m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s )多克隆位点L B ( L u r i a B e r t a n imedium)LB培养基M c A b ( m o n o c l o n a la n t i b o d y )单克隆抗体A m p ( a m p i c i l l i n
4、)氨苄青霉素D T T ( d i t h i o t h r e i t 0 1 )二硫苏糖醇D M S O ( d i m e t h y ls u l f o x i d e )二甲基亚砜学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果文中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医学科学院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本
5、人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山东省医学科学院。论文作者签名笨莲壹、导师签名：日期：翟翌2 年工月丝日一D山东省医学科学院硕士学位论文人角质细胞生长因子2 的基因克隆、表达、纯化及活性检测专业：研究生：导师：免疫学余德荣游力中文摘要目的角质细胞生长因子2 ( k e r a t i n o c y t eg r o w t hf a c t o r2 ，K G F 2 ) 是成纤维细胞生长因子家族中的2 3 个成员之一，又称为成纤维生长因子1 0 ( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r1 0 ，F
6、G F l 0 ) 。人K G F 2 是1 9 9 7 年E m o t o 等首先从人的肺中分离出的具有肝素结合特异性的单链多肽，因与1 9 8 9 年发现的K G F 在结构、性质、功能等方面的同源性而得名。K G F 2 包含2 0 8 个氨基酸，其N 端是由3 9 个疏水氨基酸组成的信号肽序列，其分子结构与小鼠的同源性达9 6 。K G F 2 由成纤维细胞和其它间充质来源的细胞分泌，特异性作用表达于上皮细胞表面的酪氨酸激酶受体，以问质一上皮相互作用的旁分泌方式有效地促进各种来源上皮细胞的增殖、移行和分化；因而有可能作为未来临床上治疗难治性上皮组织损伤和调节上皮来源器官发育的多功能生
7、物制剂。国外关于K G F 2 的研究多涉及生物学特性及功能方面，国内有关K G F 2研发的报道亦不多见，本实验试图构建高效原核表达系统，分析其在不同诱导条件下的表达量，并利用镍亲和层析一步法获得B L 2 1 p E T - 3 0 “+ ) - h K G F 2 中高纯度的重组蛋白，用于生物学功能的研究。K G F 2 生物学功能广泛，自发现以来发展迅速。研究发现，它不仅可以直接作用于上皮细胞促进伤口边缘细胞再生和损伤修复，还可通过问接刺激其它细胞因子的分泌促进肉芽组织的形成，减少疤痕的形成。文献报道K G F 2 对多种因素如急慢性炎症、溃疡、物理化学烧伤等引起的组织器官损伤的修复过
8、程发挥重要作用，如对放化疗引起的小鼠口腔粘膜炎、胃肠道粘膜损伤及溃疡性结肠炎具有明显的治疗作用；对小鼠皮肤切割伤和大鼠皮肤烫伤的愈合亦有明显的促进作用；且K G F 2 在整个脊椎动物的胚胎发育过程中起着不可替代的作用，参与并调山东省医学科学院硕士学位论文控多种组织和器官的形成和分化，如在四肢、肺支气管、牙龈、胰腺、脑垂体、眼睑和皮肤及下颌腺等器官的发育和成熟过程中的重要作用。美国人类基因组公司( H u m a nG e n o m eS c i e n c e s ，H G S I ) 开发的R e p i f e m i n ( K G F 2 ) 针对难治性上皮损伤进行的多项临床试验，
9、证实了K G F 2 良好的稳定性及安全性。因而K G F 2 将是一种继表皮生长因子之后更具开发和应用前途的多功能制剂，前景良好本实验的研究目的是建立含有h K G F 2 的重组表达载体，并筛选不同诱导条件下目的蛋白表达量较高的高效稳定表达菌株，优化表达及纯化方法，利用相应方法纯化出高纯度重组蛋白，并检测其生物学活性，为K G F 2 的大规模生产及应用研究奠定基础方法及结果I h K G F 2 的基因克隆及序列分析根据文献报道和G e n b a n k 上人K G F 2 基因序列，设计一对扩增人K G F 2 基因的引物，上游引物含有E c o R I 位点和A T G 起始密码子
10、，下游含有B a m H I 位点和终止密码子的反密码子1 1 A 。收集5 C 0 2 、3 7 传代培养下生长状态良好的人胚胎肺成纤维细胞，采用异硫氰酸胍法提取培养的细胞总R N A ，并逆转录合成h K G F 2c D N A 第一链，再以完整的c D N A 和上述引物用P C R 方法扩增h K G F 2 基因片断；用低熔点琼脂糖法分离和纯化P C R 产物后与p M D l 8 - T 载体相连接，转化大肠杆菌D I t S t x 癌g 受态细菌涂布于含1 0 0 u g m l 氨苄青霉素的L B 固体培养基上，菌落P C R 及限制性酶谱分析筛选阳性克隆。阳性质粒经I n
11、 v i t r o g e n 生物技术有限公司测序，所克隆基因片段与预期的完全一致，成功构建T p M D l 8 h K G F 2 重组克隆载体。2 成熟人K G F 2 在p B V 2 2 0 表达载体中的表达及鉴定将p M D l 8 h K G F 2 重组克隆载体及原核表达载体p B V 2 2 0 分别用E c o RI 、B a m HI 双酶切，分别用低熔点琼脂糖法分离和纯化目的基因片段h K G F 2 集载体片段后，经T 4 D N A 酶连接，构建重组表达载体p B V 2 2 0 - h K G F 2 。将连接产物转化大肠杆菌D H S a 感受态细菌涂布于含
12、1 0 0 u g m l 氨苄青霉素的L B 固体培养基上3 0 培养过夜，利用菌落P C R 初步筛选后，挑取阳性克隆菌株接种于L A 培养基中3 0 振荡过夜培养。采用树脂法小量提取质粒，E c o R I 、B a m H l 双酶切鉴定，确定定向插入的阳性克隆。吸取阳性菌液按1 ：1 0 0 接种至含0 2 葡萄糖及1 0 0u g m l 氨苄青霉素的L B 液体培养基中，3 0 振摇培养，当菌液O D 6 0 0 达0 6 时立即移至4 2 ，热诱导4 h 后，4 0 0 0 1 p m ，4 “ C 离心，1 0 r a i n 后收集细菌。用B i o - r a d 垂直电
13、泳系统山东省医学科学院硕士学位论文进行S D S - P A G E 和W e s t e mB l o t t i n g 分析重组蛋白，凝胶图像扫描系统分析结果显示重组蛋白的表观分子量约2 3 K D ，和理论值稍有差异，可能受蛋白质折叠后所带电荷、酸碱度及受电泳性质等因素影响，重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的1 0 。将酶切鉴定阳性的重组质粒p B V 2 2 0 - h K G F 2 分别转化E c o l iD H S a 、Ec o l iJ M l 0 9 、E c o l iB L 2 1 ( D E 3 ) ，并优化表达条件，结果发现在E c o l iJ M l 0 9 中
14、最大表达量约占菌体总蛋白1 5 。按上述方法扩增表达菌株，离心收集细菌，超声破碎，离心分别收集上清和沉淀，进行1 4 S D S P A G E 电泳，发现表达产物以可溶性蛋白的形式存在于裂解上清中，而非存在于包涵体内。3 成熟人K G F 2 在p E T - 3 0 a ( + ) 载体中的表达、鉴定、纯化及生物学活性检测由于h K G F 2 在p B V 2 2 0 表达载体中的表达量较小不利于后续的纯化及大规模生产及应用研究，实验又选用p E T - 3 0 a ( + ) 载体表达目的蛋白。为将h K G F 2 基因克隆) L p E T - 3 0 a ( + ) 中，必须重新
15、设计一对引物，上游含有N d eI 位点及保护碱基 G G A A T r C ，下游含有B a m HI 位点及保护碱基C G 。以测序正确的p M D l 8 h K G F 2重组克隆载体为模板，以新合成引物重新扩增h K G F 2 基因；分别用N d eI 和B a m H1 分别对h K G F 2 基因P c R 产物及原核表达载体p E T - 3 0 a ( 4 - 1 进行双酶切后相连接、转化非表达宿主大肠杆菌D H S a ，涂布于含有2 5 u g m l 卡那霉素的u 涸体培养基上，按上述同样方法鉴定筛选阳性重组克隆。制备表达宿主B L 2 1 ( D E 3 ) 感
16、受态细胞，提取酶切鉴定阳性的p E T - 3 0 a ( + )一h K G F 2 重组质粒转化B L 2 1 ( D E 3 ) 感受态细胞接种于含有2 5 u g m l 卡那霉素的L B 固体培养基上，3 7 培养过夜。从新鲜的培养平板中挑取单克隆菌落，将含有p E T - 3 0 a ( + ) 一h K G F 2 重组质粒的B L 2 1 ( D E 3 ) 表达菌接种于含有卡那霉索的L B 液体培养基中3 7 振荡至O D o = 0 8 时，终浓度为l m M 的I P T G 诱导表达4 h ，S D S P A G E 和W e s t e r nB l o t t i n g 分析重组蛋白，分析结果显示重组蛋白的表观分子量约2 3 K D ，和理论值稍有差异，可能受蛋白质折叠后所带电荷、酸碱度及受电泳性质等因素影响，重组蛋白表达量约占菌体总蛋白2 5 。为研究重组h K G F 2 的生物学活性，对重组p E T - 3 0 a ( + ) 一h K G F 2 按上述
