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1、人抗中性粒细胞胞浆抗体(cANCA) IgM 酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用最低检测限:1 ng/ml特异性:本试剂盒可同时检测人 cANCA (IgM),且与其他相关抗体无交叉反应。有效期:6 个月预期应用:ELISA 法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中 cANCA (IgM)含量 。说明1试剂盒保存:-20(较长时间不用时);2-8(频繁使用时)。2浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。3中、英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准。4刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。实验原理用中性粒细胞
2、胞浆包被酶标板,制成固相载体。向微孔中先加入待测样品进行反应,然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 进行反应,经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 cANCA (IgM)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品中抗体的效价(抗血清最终能显色的最高稀释倍数记为效价)。试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板(Assay plate ):一块(96 孔)。2. 样品稀释液(Sample Diluent):120ml/瓶。3. 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 稀释液 (HRP-an
3、ti-human IgM Diluent):110ml/瓶。4. 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM(HRP-anti-human IgM):1120l/瓶(1:100)。5. 底物溶液(TMB Substrate):110ml/瓶。6. 浓洗涤液(Wash Buffer):120ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。7. 终止液(Stop Solution):110ml/瓶(2N H2SO4)。需要而未提供的试剂和器材1. 标准规格酶标仪2. 高速离心机3. 电热恒温培养箱4. 干净的试管和 Eppendof 管5. 系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器6. 蒸馏
4、水,容量瓶等标本的采集及保存1. 血清:全血标本请于室温放置 2 小时或室温过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20或-80保存,但应避免反复冻融。2. 血浆:可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂,标本采集后 30 分钟内于 2 - 8 C 1000 x g 离心 15分钟,或将标本放于-20或-80保存,但应避免反复冻融。3. 细胞培养物上清或其它生物标本:1000 x g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20或-80保存,但应避免反复冻融。注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。标本的稀释原则:首先通过文献检索的方式
5、了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。稀释的过程中,应做好详细的记录。最后计算抗体效价时,稀释了“N”倍,标本中抗体的效价为“N”。辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 的稀释原则:临用前以辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔 100l),实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如10l 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 加 990l 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。操作步骤实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡 。如样品浓度过高时,用样品稀释液进
6、行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。1. 加样:分别设空白孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100l,余孔加待测样品 100l,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37反应 120 分钟。2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 工作液 100l(取 1l生物素标记抗体加 99l 生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37,60 分钟。3. 温育 60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 5 次,每次浸泡 1-2 分钟,350l/每孔,甩干 。4. 依序每孔加底物溶液 90l,3
7、7避光显色(30 分钟内,此时肉眼可见孔内有明显蓝色,即可终止)。5. 依序每孔加终止溶液 50l,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。6. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后 15 分钟以内进行检测。注:1. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。2. 每次实验留一孔作为空白调零孔, 该孔不加任何试剂, 只是最后加底物溶液及 2N H2SO4。测量时先用此孔调 OD 值至零。3. 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的
8、密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。4. 未使用完的酶标板或者试剂,请于 2-8保存。辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 工作液。5. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。洗板方法手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸 ,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内,浸泡 1-2 分钟。根据需要,重复此过程数次。自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算为检测样品中 cANCA (IgM)效价,客户可以采取样品 2 倍倍比稀释样品计算抗体效价,一般采取以 1:40 为起始稀释倍数(使用样品稀释液进行稀释)。最大稀释倍数根据客户自身试验要求而定,最终显色与阴性对照孔进行比较,有明显差异的最大稀释度定为抗体的最终效价。注意事项1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。2. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。3. 一次加样时间最好控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。4. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。5. 在配制检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。6. 底物请避光保存。7. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。