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1、 硕 士 学 位 论 文 题题 目：草鱼细菌性败血病的病原、病因及灭活疫苗研制目：草鱼细菌性败血病的病原、病因及灭活疫苗研制 英文题目：英文题目： Study on pathogen, etiology and inactivated vaccine of bacterial septicemia of grasscarp Ctenopharyngod idellus 姓 名 陈 博 学 号 10908044 导师姓名 李 远 友 职 称 教 授 专 业 海 洋 生 物 学 入学日期 2009 年 9 月 答辩日期 2012 年 5 月 学位论文原创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的工作
2、研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权声明 本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档， 允许论文被查阅和借阅； 学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校并可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、 借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。 本论
3、文属于：保密( )，在 年解密后适用本授权声明。 不保密( )。 (请在以上括号内打“”) 作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日摘要 I 摘 要 草鱼(Ctenopharyngod idellus)是我国重要的淡水养殖经济鱼类，也是潮州市的重要水产养殖品种。近几年来，每年 8 到 11 月份，潮州市江东镇养殖区的草鱼细菌性败血病病害严重，经济损失较大。为了找到该病的预防和控制方法，本课题组从病原、病因、疫苗研制及其效果评价等方面对草鱼细菌性败血病进行了较系统的研究，主要结果如下： 一、江东养殖区细菌性败血病爆发的主要原因 本研究主要从养殖池塘的水质环境和饲养管理等方面
4、探讨细菌性败血病爆发的主要原因。2010 年 8 月到 2011 年 3 月的八个月期间，在江东养殖区分别选取有发病史和没发病史的对照池塘各 3 个， 对其发病情况和水质每月进行 1-2 次监测，检测的水质指标有水温、溶解氧、pH、氨氮、亚硝态氮和无机磷。结果发现：有发病史的池塘 8-11 月出现了细菌性败血病，无发病史的池塘未发现该疾病； 该病的爆发呈现出较明显的季节性变化， 在水温较高的8到9月发病严重，一直持续到 11 月份，在水温较低的 12 月到次年 3 月份期间较少发生。与未发病池塘相比，发病池塘在 8 月和 9 月份的氨氮含量显著升高(P0.05，说明不存在显著性差异；P0.05
5、) 陈博 汕头大学硕士学位论文 16 图 2-6 水体亚硝酸盐平均含量月变化 Fig. 2-6 Monthly variations of average NO2-N in the waters (n=3) (2) 实验期间不同池塘水体无机磷月变化 实验期间水体中无机磷(PO43-P)含量变化如图 2-7 所示， 从 2010 年 8 月份开始到 11 月份水体中无机磷含量处于较低水平，保持在 0.01mg/L 以下，从 11 月份开始升高一月份达到峰值(0.34mg/L)，1 月到 3 月份一直下降；未发病池塘 8月和9月份池塘养殖水体磷平均含量较高均为0.23mg/L， 10月份下降至0.
6、04mg/L，10 月到 3 月期间一直处于较低水平，2 月份为最低，含量为 0.02mg/L。 图 2-6 水体无机磷平均含量月变化 陈博 汕头大学硕士学位论文 17 Fig. 2-6 Monthly variations of average PO43-P in the waters (n=3) 2.3.4 饲养管理情况 发病的 3 个池塘和未发病的 3 个池塘，水源均来自韩江，发病池塘为封闭型池塘主要以草鱼养殖为主，池塘内有少量鲢鱼和鳙鱼，养殖密度为 4000 尾/亩，每年清塘一次并彻底换水，每天早中晚用投喂机投喂草鱼配合饲料各 1 小时，投喂量较大，池塘均未安装打氧机设备；未发病的 3
7、 个池塘为开放型池塘主要养殖草鱼为主，池塘内养殖少量鲢鱼，鲫鱼和鳙鱼，养殖密度为 3000 尾/亩，池塘有进出水口，为流动水源，每年彻底清塘换水一次，平时注重水质调节，每天早中晚各投喂草鱼配合饲料一次，投喂量是当日情况而定，日均每尾投喂量低于发病池塘投喂量，池塘安装有打氧机，气温较高时会开打氧机增加水体氧溶解量。 2.4 讨论 2.4.1 温度、溶解氧、pH 及池塘藻类与疾病爆发的关系 影响鱼类发病的外界原因很多，温度是一个非常重要的因素，鱼类是变温动物，不同种类及不同发育阶段的鱼类对水温有不同的要求，水温对幼鱼的影响很大，如出孵出的鱼苗只能适应2的温差，6cm 左右的小鱼能适应5的温差范围，
8、 否则就会生病。 水温还能影响鱼类的呼吸频率和新陈代谢(汪开毓， 2011)。夏天天气闷热，气压低，鱼的采食量会下降容易产生浮头(丁丽华，2006)。温度不仅对鱼类有重要影响，对其它水产动物如虾蟹类也有很大影响，如Steenbergen(1978)、Vargas-Albores(1998)等发现，长时间的水温过高能使蟹和虾的血细胞酚氧化酶活力和吞噬活力等降低， 从而影响蟹虾的抗病能力(Cheng et al, 2000)。8-9 月份江东养殖区处于高温季节，水温在 30以上，持续高温能够使藻类和细菌大量滋生，消耗水体溶氧使溶氧降低，不利于鱼类生长，也可能影响鱼类自身的免疫和抗病能力， 这可能是
9、发病池塘在 8 月和 9 月发病比较严重的原因；细菌性败血病的主要病原为嗜水气单胞菌，该菌的最适生长温度为 25-37(彭书练，2001)，我们调查发现 8 月到 11 月份水温为 20.39-31.43之 12 月份水陈博 汕头大学硕士学位论文 18 温降至 17.7，之后水温继续降低，病害也随之消失，因此我们推测水温与病害的发生有很大关系，水温较高时利于病原菌生长，易发病，水温较低时不利于病原菌生长，病害随之消失。 水体中溶解氧是水生生物赖以生存的必要条件， 水体中氧气的来源主要是池塘中的浮游植物光合作用和空气中的氧气。战凤茶(1989)研究发现在缺氧状态下鱼类的呼吸频率和心搏会加快，鱼类
10、会出现浮头，摄食量下降，进而影响饵料效率。溶氧不足会造成水体中 NH3、H2S、NO2浓度升高，造成氨氮和亚硝氮毒性增加，并且在低氧状态下水产动物对氨氮和亚硝氮的耐受力会下降，对疾病的防御力降低(James, 1985)。一般情况下溶解氧需要在 4mg/L 以上鱼类才能正常生长(汪开毓，2011)，当溶解氧过低时鱼类会生长不良，出现浮头低于 1mg/L 时还会窒息死亡。实验发现发病池塘的月平均溶氧均低于未发病池塘，在 9 月份仅为3.91mg/L，而未发病的池塘均在 5 mg/L 以上。这可能是促使疾病发生的原因之一，造成溶氧较低的原因与发病池塘养殖密度较大有直接关系。 养殖水体 pH 对与鱼
11、类的生长非常重要，养鱼要求水体的 pH 在 6.5-8.5 之间较为合适，pH 值过低，水体处于酸性环境中，细菌、藻类和浮游动物生长发育受到影响，代谢物质循环强度下降，鱼虽然可以生存，但是生长缓慢，血液 pH降低不利于体内氧气的运输，从而影响健康；pH 值过高则会腐蚀鱼鳃和皮肤，影响新陈代谢(汪开毓，2011)。本研究中未发病池塘除 9 月份外，其他月份 pH都高于发病池塘，但发病池塘和未发病池塘 pH 都适合鱼类生长，说明此次发病与 pH 的关系不大。 池塘中浮游植物特别是藻类对溶氧具有非常重要的作用， 多数绿藻可以作为鱼类的饵料，因此养好池塘藻类对养鱼非常重要。蓝藻繁殖对温度敏感，在水温1
12、7 以下时，不会大量发生，或者不会对鱼类构成危害。当水温上升到 28 时， 蓝藻很容易形成优势种群而大量爆发。 蓝藻在高温强光照的天气在水体表层，吸收了大部分的阳光，自己大量繁殖的同时会抑制其它藻类的生长。蓝藻的大量繁殖，会不断向水体分泌有毒代谢物质，可引起一些浮游动物的大量死亡。同时蓝藻大量生长会由于种内竞争而死亡，死亡后分解会消耗大量的溶氧，释放大量硫化氢等有毒物质，不利于鱼类生长。在 8-10 月份水温较高，8 月和 9 月均在30以上，利于蓝藻的生长，这可能是发病池塘蓝藻含量较高和溶氧底的原因。 陈博 汕头大学硕士学位论文 19 从以上情况说明，发病池塘细菌性败血病爆发与持续高温、池塘
13、溶氧低和蓝藻尤其是微囊藻含量过高等有关。 2.4.2 氨氮、亚硝氮、无机磷与疾病爆发的关系 水产养殖中氨氮通常作为水生植物生长的重要氮源(张东鸣，1999)，但是水体含量较高的氨氮和亚硝酸盐对水生动物是有害的，胡义波等(2005)研究发现1mg/L的非离子氨氮和亚硝氮对罗氏沼虾作用10天后， 引起了血清中酚氧化酶、超氧化物酶等非特异性免疫指标显著变化，降低了其免疫能力。氨氮和亚硝氮会影响鱼类正常摄食和呼吸，对鱼体组织指标和生理指标能造成严重影响(Hargreaves and Kucuk，2001；Randall and Tsui，2002；夏苏东等，2009)，大量研究发现， 非离子氨氮和亚硝
14、态氮是鱼类发病的主要环境因子(赵玉宝等， 1994；蒋艾青等，2005)。氨氮主要来自沉入池底的饲料、鱼的排泄物、肥料等，氨氮浓度过高会影响鱼类的生长，甚至发生中毒现象引起死亡。养殖水体中的亚硝酸盐主要来自水环境中有机物分解的中间产物， 当氧气充足时可转化为对鱼类和虾蟹毒性较低的硝酸盐，缺氧时转化为毒性较高的氨氮。亚硝态氮对鱼类的主要危害是与鱼体内血红素结合成高铁血红素从而失去结合氧的能力，造成缺氧死亡(汪开毓等，2011)。本研究中发病池塘在 8 月和 9 月份间水体氨氮含量均显著高于未发病池塘(P0.05，说明不存在显著性差异；P0.05)。 陈博 汕头大学硕士学位论文 42 图 4-4
15、实验组和对照组酸性磷酸酶活力 Fig. 4-4 The acidic phosphatase activity of immunized and control groups 注：*表示实验组和对照组差异显著，P0.05)。 陈博 汕头大学硕士学位论文 43 图 4-5 实验组和对照组碱性磷酸酶酶活力 Fig. 4-5 The alkaline phosphatase activity of immunized and control groups 注：*表示实验组和对照组差异显著，P0.05 4.3.4 免疫保护力 在免疫 28 天后进行攻毒实验， 每尾注射浓度为 1.0 107cfu/mL 的嗜水气单胞菌活菌液 0.3mL，经过 12 天的观察结果如图 5-6 所示：免疫组从第三天开始出现死亡，一直持续到第 6 天，共死亡 8 尾鱼，累积死亡率为 26.67%；对照组从攻毒后第 2 天开始出现死亡，一直持续到第 7 天，共死亡 28 尾鱼，累积死亡率为 93.33%；死亡草鱼均出现典型细菌性败血病症状。通过公式：相对免疫保护率=（ 1-免疫组死亡率/对照组死亡率）100%，计算得到免疫组草鱼的相对免疫保护率为 71.43%。 陈博 汕头大学硕士学位论文 44 图 5-6 攻毒后实验组和对照组累积死亡率
