《aFGF、bFGF在膀胱癌中的表达，对膀胱癌细胞株EJ细胞的作用及机制的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《aFGF、bFGF在膀胱癌中的表达，对膀胱癌细胞株EJ细胞的作用及机制的研究（58页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、譬8 0 1 3分类号墅塑! !审回鳝拜太拳单位代码：l O l 5 9学号：1 9 9 9 1 7 1 0 8博士学位论文题目：! 篁垦! ! 垒里曼! 查照咝瑾主鳆墨鎏：过壁壁痤麴照挂旦麴麈鳇丝星蕉扭笪笪班塞研究生：卜f ：戈论文起止时间：2 哩兰旦= 塑! 生兰旦中文摘要刖菁膀胱移行细胞癌在我国是泌尿外科最常见的恶性肿瘤。浅表性肿瘤容易复发；而侵袭性肿瘤或有转移者预后不佳。虽然手术技巧和化疗方案不断进步，但膀胱肿瘤的治疗目前仍不十分满意。因此有必要深入了解膀胱肿瘤的发病原因和机制，以期为膀胱肿瘤的治疗提供新的尝试。有研究显示酸性成纤维细胞生长因子( a F G F ) 、碱性成纤维细胞生
2、长因子( b F G F ) 和表皮生长因子( E G F ) 等肽类生长因子与膀胱肿瘤的发生和发展密切相关，a F G F 和b F G F 在膀胱移行细胞癌患者尿中的水平增高，且与分期相关。本 研究拟从m R N A 水平上检测a F G F ，b F G F 及F G F R l 在人膀胱移行细胞癌组织中的表达，探讨它们的表达与膀胱癌发生，发展的关系。本研究还以膀胱癌细胞株E J 细胞为研究对象，观察a F G F ，b F G F 对E J 细胞增殖的影响；并对E J 细胞施加c e n i s t e i n 和P D 9 8 0 5 9 ，观察G e n i s t e i n 和
3、P D 9 8 0 5 9 对E J 细胞增殖的影响，推测肿瘤细胞的信号传导机制，探讨G e n i s t e i n 和P D 9 8 0 5 9是否对膀胱肿瘤有治疗作用。实验材料与方法一、实验材料标本：6 3 例膀胱移行细胞癌标本来自1 9 9 9 2 0 0 2 年间在我科手术治疗的患者，标本常规福尔马林固定，石蜡包埋；其中2 0 例患者的新鲜标本冻 存于一7 0 冰箱，留作R T P C R ；用于对照的6 例正常膀胱组织均来自行开放手术的B P H 患者，所有标本均经病理证实。细胞株：膀胱癌细胞株E J 细胞购自北京大学泌尿外科研究所。试剂：1 R T P C R 试剂盒购自大连宝
4、生物工程公司。2 a F G F 原位杂交( I s H ) 及原位末端标记细胞凋亡检测( T U N E L ) 试剂盒购自武汉博士德公司。3 a F G F 、b F G F 购自北京邦定公司；G e n i s t e i n 购自s i g m a 公司；P D 9 8 0 5 9购自P r o m e g a 公司；1 4 P R M l l 6 4 0 培养基、新生牛血清购自G i b c o 公司。5 M T T 购自n u k a 公司。6 ( 1 一P 2 ) A T P 购自j 匕京亚辉生物制品公司。二、实验方法1 R T P c R 检测a F G F 、b F G F
5、及F G F R 一1 的m R N A 在正常及膀胱癌组织中的表达。I S H 检测a F G F 的m R N A 在膀胱癌组织中的定位表达。2 ，用不同剂量的a F G F ，b F G F ，G e n i s t e i n ，P D 9 8 0 5 9 刺激E J 细胞；M T r法检测细胞增殖；T U N E L 法检泓细胞揭亡。3 ，检测a F G F 对E J 细胞的E R K 活性的影响，推测肿瘤细胞内信号传导的途径。实验结果l ，R T P C R 证实a F G F 、b F G F 及F G F R l 的m R N A 在膀胱癌组织中的表达明显高于它们在正常组织中的
6、表达( P 0 0 5 ) 。b F G F m R N A 在表浅性】6 T C C ( T a T 1 ) 和侵润性T C C ( 1 2 一T 4 ) 中的平均半定量值为0 8 3 O 0 6和0 9 l 0 0 6 ，两者间的差异有显著意义( P 0 0 5 ) 。a F G F m R N A 的强阳性表达主要位于肿瘤间质，以血管周围最为显著。( 图1 4 1 7 )表1R T P C R 检测& F G F 、b F G F 、F G F R 一1r I 删A 的表达1 7 表2I S H 检测a F G F m R N A 的表达一一一分组例数一+强阳性率 ( + + ，+ +
7、+ ) 正常65l0 6T a T l2 7他一T 43 6G l1 7G 23 0G 31 6转移61 81 9l O2 0721 637867 4 1 ( 2 0 2 7 )9 7 2 ( 3 5 3 6 )7 6 5 ( 1 3 1 7 )9 0 O ( ”3 0 )9 3 8 ( 1 5 1 6 )1 0 0 ( 6 6 ) 无转移5 7l73 71 29 0 0 ( 4 9 5 7 )论文图片L a n e ：123456789lOMB a c t i n a F G F一一7 7 0 b p一2 l O b D图1 1R T P C R 检测a F G F 的电泳照片：L a n
8、e l ：n o n n a l ；L a n e 2 ：T a ：L a n e 3 ，4 ：T l ；L a n e 5 ，6 ：r 1 2 ；L a n e 7 1 0 ：T 3 一T 4 L a n e l l ：M a r k e r 1 8 L a n e ：l23456789lOM8 。a c t i n b F G F一一7 7 0 b D一2 1 0 b D1 2R T P C R 检测b F G F 的电泳照片：L a n e l ：n o 珊a I ；e 2 ：T a ；I 锄e 3 ，4 ：T 1 ；h n e 5 ，6 ：，1 2 ；h n e 7 一l O ：钙一T
9、 4 e l l ：M a r k e r L a n e ：12345678910M昼a c t i n F G F R 1 一7 7 0 b p 一4 9 5 碲图l 。3R T P C R 检测F e F R 一1 的电泳照片：k e l ：n o m a l ；k n e 2 ：T a ；I 舢，4 ：T 1 ；h I l e 5 ，6 ：他；L 丑e 7 1 0 ：T 3 一T 4 h I l e l l ：M a r k e r 1 9 图1 4I S H ：a F G F m R N A 的阴性照片，x l o o 。图1 5I S H ：郴F m R N A 的阳性照片：间质血
10、管周围可见大量染成棕黄色的阳性细胞，1 0 0 。2 0 -图1 6I S H ：a F G F m R N A 的阳性照片：闻质小血管周围可见染成棕黄色的阳性细胞，肿瘤细胞未见染色，4 0 0 。图1 7I s H ：a F G F m R N A 的阳性照片：染成棕黄色的阳性细胞位于间质，肿瘤上皮细胞未见染色，2 0 0 。- 2 l 讨论膀胱移行细胞癌( T C C ) 是我国泌尿外科最常见的恶性肿瘤，浅表性肿瘤容易复发；一旦发展为侵袭性肿瘤或出现转移则预后不佳，虽然目前的手术技巧H 和围手术期联合化疗K 1 较以前有了很大进步，但对膀胱肿瘤的治疗仍不是很满意。膀胱肿瘤的病因和发病机制目
11、前尚不十分清楚，近来的研究提示：酸性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子以及表皮细胞生长因子等肽类生长因子与T C C 的发生、发展关系密切哺o 。a F G F 是成纤维细胞生长因子家族中的重要一员，是由1 2 0 个氨基酸残基组成的多肽链，分子量约1 6 一1 8 K D ，它对中胚层及神经外胚层来源的细胞有促分裂作用，有强烈的生血管作用，体外实验证明，a F G F 对膀胱癌细胞除有促增殖作用外，还可促进细胞扩散，使细胞变形，可能参与肿瘤的侵袭与转移扩善1 。本实验采用R T P c R 和I s H 方法，从m R N A 水平检测a F G F在膀胱癌中的表达，我们发现a F
12、G F 在膀胱癌缀织中的表达明显高于在正常组织中的表达，且随分期增加面增高，c h o p i n p 等人应用免疫组织化学方法进行的研究也得到了类似的结论，他们还发现T C C 患者尿中的a F G F 水平也高于正常对照组，与分期有关。这些结果说明a F G F 与膀胱移行细胞 癌的发生和侵袭密切相关。本实验应用I s H 发现a F G F 的强阳性染色主要位于间质血管周围，提示a F G F 在T C C 中有促进血管形成的作用，而异常新生血管的形成不仅是膀胱肿瘤早期复发的重要因素，也是肿瘤获褥侵袭和转移能力的重要标志。J j u a n n e a u 等人进行的实验证实，一小部分产
13、生a F G F 的肿瘤细胞，可使整个细胞群的致瘤性增强，可使转移出现的时间缩短；这些都提示a F G F 与T c C 的转移密切相关，而本组中6 例有转移者的a F G F 均为强阳性表达，显著高于无转移者，也支持这一结论。b F G F 也是成纤维细胞生长因子家族中的重要一员，b F G F 由1 4 6 个氨基酸组成多肽链，人的b F G F 分子量为1 8 K D ，b F G F 与a F G F 的一级结构有5 5 的同源性，二者功能相近。b F G F 是多种细胞的强有力的丝裂原，影响诸如激酶产生、细胞迁移、血管生成等多种细胞功能H 2 ，1 3 j 。近来的研究显示b F G
14、 F 与膀胱恶性肿瘤之间关系密切，在膀胱癌患者的尿中发现有b F G F的存在“，在人侵袭性膀胱癌细胞株中也检测到b F G F 及其受体的m R N A 【1 引。N g u y e n 等人发现膀胱癌患者尿中b F G F 水平高于正常人，而且增2 2 高程度与肿瘤的分期密切相关“。我们应用R T P C R 证实膀胱移行细胞癌癌组织中b F G F m R N A 水平显著高于正常对照组，其增高与分期密切相关，与分级无明显相关。说明b F G F 主要与膀胱移行细胞癌的侵袭有关，而对细胞分化无明显影响。a F G F 、b F G F 必须与其受体结合才能发挥作用，F G F R l 是
15、F G F 家族受体中的一员，由三部分组成：i ) 细胞内酪氨酸蛋白激酶活性结构域，i i ) 疏水氨基酸组成的跨膜结构，i i i ) 细胞外由三对C y s 形成的3 个免疫球蛋白样重复序列组成的配基结合域。a F G F 、b F G F 均可与F G F R l 结合，有研究提 示a F G F 、b F G F 可能通过增强F G F R 一1 在细胞表面的表达来发挥作用6 ” ，而应用F G F R l 抑制剂S U 5 4 0 2 能够抑制F G F 诱导的P C I 2 细胞的增殖引。F G F R 一1 的基因定位与8 p 1 2 ，其扩增或缺失与膀胱肿瘤的高期、高级、预后差呈明显正相关。本研究中，F G F R 一1 m R N A 在膀胱移行细胞癌癌组织中的半定量值明显高于其在正常组织中的数值，而且随分期增高而增加。说明F G F R l 与膀胱癌的侵袭密切相关。本研究发现a F G F 、b F G F 和F G F R l 在膀胱癌组织中的表达均增高，而且都与肿瘤的分期密切相关，我们推测a F G F 、b F G F 及F G F R 一1 可能以自分泌或旁分泌的方式在膀胱移行细胞癌的发生、侵袭、复发及转移过程中起重要作用。可以将它们
