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1、中南大学博士学位论文RSV感染影响气道神经可塑性机制的研究及与气道高反应性的关 系姓名：沈小玥申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：吴鄂生20050501博士学位论文中文摘要摘要呼吸道合胞病毒( r e s p i r a t o r ys y n c y t i a lv i r u sR S V ) 感染遍及世界各地，是婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的主要病原体之一， 严重威胁婴幼儿健康。人群对R S V 普遍易感，与日后发生反复喘息和哮喘密切相关。参考本室已成功建立的W i s t a r 大鼠R S V 感染模型， 我们选择了s D 大鼠，建立感染模型。目前对R S V 感染后引起气
2、道高 反应性致哮喘的机制还不清楚。近年来发现R S V 感染后存在的“神经 源性炎症”与气道高反应性有关，但无法解释R S V 感染患者经过数年甚至十余年后仍存在气道高反应性和哮喘发生率显著高于正常人群。病理情况下神经营养因子的过度分泌引起气道神经网络结构和功能的改变( 即神经可塑性，N e u r a lP l a s t i c i t y ) 。R S V 感染其中是否存 在神经可塑性改变还须进一步研究。如果存在，R S V 感染后引起气道 神经网络结构和功能的改变( 即神经可塑性，N e u r a lP l a s t i c i t y )可能是R S V 感染长时间后发生气道高反
3、应性和哮喘的关键。实验表 明，R S V 感染的大鼠肺组织表达N G F 及其受体显著升高。本实验在我 们研究R S V 感染引起气道炎症的基础上，进一步探讨了R S V 感染是否导致气道神经可塑性改变和背根神经节突触囊泡素、神经丝表达的变化及N G F 抗体干预对其的影响。发现R S V 感染可引起大鼠的气道和c ，一T 。段脊神经节N F 、S Y N 表达的增加，其中S Y N 表达与其气道反应性 程度呈正相关，N G F 在其中起重要作用。这为哮喘的防治探索了一条新的途径。第一部分R S V 感染对s D 大鼠气道神经可塑性的影响及与气道高反应性的关系目的：建立呼吸道合胞病毒( r e
4、 s p i r a r ys y n c y t i a lv i r u sR S V ) 感 染s D 大鼠致支气管炎的动物模型。研究R S V 感染后s D 大鼠气道神经 可塑性的改变及N G F 抗体干预对其的影响以及和气道反应性的关系。 方法：R S V 病毒接种组大鼠1 0 只，R S V + N G F 抗体干预组1 0 只，对照组大鼠1 0 只。三组分别于8 周和1 2 周进行气道反应性测定、取出肺组织，进行肺组织光镜检查，检测气道炎症。免疫组化法检测大鼠气道突触囊泡素、神经丝的表达。免疫电镜法检测大鼠气道突触囊泡素的表达。结果：博士学位论文中文摘要1 ) S D 大鼠气道炎
5、症的测定：R S V 接种后大鼠肺组织出现较严重的支气管炎的病理改变N G F 抗体干预可以明显减轻R S V 感染大鼠支气管炎的病理改变 2 ) S D 大鼠气道反应性测定：单纯吸入P B S 的基础值各组大鼠问的气道阻力基本无差别( P o 0 5 ) 。在R S V 组随着盐酸组胺浓度的升高， 气道阻力增高明显。在R S V + N G F 抗体组当低浓度盐酸组胺诱导时，腹 腔注射N G F 抗体即表现出对气道阻力增高的抑制。在R S V 组1 2 周大 鼠气道阻力增高明显大于8 周大鼠，有统计学差异( P 0 0 5 ) 3 ) 大鼠气道免疫组化结果显示：R S V 感染可引起大鼠气道
6、突触囊泡 素可塑性改变，N G F 在其中起重要作用，并且随着气道突触囊泡素表达量的增加s D 大鼠气道反应性也随之增加，表现为各组气道突触囊 泡素表达密度值与气道反应性呈正相关。S Y N 在8 周对照组和1 2 周对照组大鼠气道中表达较少，在两对照组间无显著性差异( P 0 0 5 ) 。 8 周和1 2 周R S V 组S Y N 表达大于对照组( P 0 0 5 ) 。神经丝在8 周对照 组和1 2 周对照组大鼠气道中表达在8 周对照组和1 2 周对照组问无显 著性差异( P 0 0 5 ) 。8 周和1 2 周R S V 组N F 的表达明显大于对照组 ( P 0 0 5 ) 。R
7、S V + N G F 抗体组大鼠N F 的表达与对照组相C g ( v o 0 5 ) 。 8 周和1 2 周R S V + N G F 抗体组N F 的表达明显小于R S V 组( P O 0 5 ) 。5 ) S Y N 免疫电镜显示：用S Y N 一抗和D A B 显色对气道平滑肌层超薄切片进行免疫电镜检测显示D A B 免疫反应阳性产物位于神经末梢，与圆形或卵圆形突触小泡胞浆膜结合。阴性对照组神经末梢内突触小泡 未见有免疫阳性染色。对照组S D 大鼠气道神经末梢突触小泡内仅可见少量的免疫阳性染色。经R S V 感染的s D 大鼠显示了气道神经末梢博士学位论文中文摘要内可见大量深染免疫
8、阳性突触小泡，经N G F 抗体预处理后的R S V 感染 s D 大鼠气道神经末梢内免疫阳性突触小泡的密度和数量明显减少。在神经末梢内的其他细胞器未见明显免疫阳性染色。结论：1 S D 大鼠鼻腔接种5 1 0 4 T C I D 5 0 O 1 M L R S V 病毒悬液，可以建立R S V 感染致支气管炎动物模型，此动物模型可以用来研究R S V 感染 的发病机理及其在气道高反应性产生中的作用。R S V 感染可引起大鼠 的气道炎症，而且在一定程度上使其反应性增高。其中N G F 起重要作用，可明显增强支气管肺过敏性炎症和气道高反应性，从而破坏肺功能。2 本实验发现R S V 感染可引起
9、大鼠的气道神经可塑性的改变，表现为气道N F 、S Y N 表达的增加，N G F 在其中起重要作用，并且随着气道S Y N 表达量的增加s D 大鼠气道反应性也随之增加明显，提示S Y N可能直接参与了气道反应性的增加，还须迸一步研究，这为哮喘的防治探索了一条新的途径。 3 R S V 病毒感染具有对s D 大鼠气道神经丝表达增高的作用。腹腔注射N G F 抗体表现出N G F 抗体几乎可以完全抑制R S V 病毒感染对 s D 大鼠气道神经丝表达增高的作用，说明R S V 病毒感染诱导气道神经丝表达升高主要为通过N G F 起作用。4 R S V 病毒感染具有对s D 大鼠气道突触囊泡素表
10、达增高的作用。 腹腔注射N G F 抗体表现出对R S V 病毒感染s D 大鼠气道突触囊泡素表达增高的抑制，但N G F 抗体并不能完全抑制R S V 病毒感染诱导的气道 突触囊泡素表达的升高，说明R S V 病毒感染诱导气道突触囊泡素表达升高除了N G F 的作用外还有其他因素的参与，还须进一步研究。第二部分R S V 感染后s D 大鼠c ，T 。背根神经节突触囊泡素、神经丝表达的变化 目的：研究R S V 感染后s D 大鼠背根神经节突触囊泡素、神经丝表达的变化、N G F 抗体干预对其的影响。方法：R S V 病毒接种组大鼠1 0 只，R S V + N G F 抗体干预组1 0 只
11、，对照 组大鼠1 0 只。三组分别于8 周和1 2 周进行气道反应性测定、取出大鼠c ，一L 脊神经节，免疫组化法检测大鼠背根神经节突触囊泡素、神 经丝的表达。R T P c R 法检测大鼠背根神经节突触囊泡素、神经丝的表达。结果：博士学位论文中文摘要1 ) 大鼠c ，一T 5 脊神经节中R T - P C R 和免疫组化结果显示：R S V 感染可引 起大鼠C T - T 。段脊神经节突触囊泡素表达增加，N G F 在其中起重要作用。S Y N 在8 周对照组和1 2 周对照组大鼠气道中表达较少，在两对 照组间无显著性差异( P O 0 5 ) 。8 周和1 2 周R S V 组S Y N
12、表达大于 对照组( P 0 0 5 ) 。8 周和1 2 周R S V 组N F 的表 达明显大于对照组( P 0 0 5 ) 。R S V + N G F 抗体组大鼠N F 的表达与对照组相似( P O 0 5 ) ；8 周和1 2 周R S V + N G F 抗体组N F 的表达明 显小于R S V 组( P O 0 5 ) 。结论：1 本实验发现R S V 感染可引起大鼠的c ，一T 。段脊神经节N F 、S Y N m R N A 和蛋白增加，N G F 在其中起重要作用。结合第一部分结果，说明R S V 感染可引起N F 、S Y N 在c ，一T 。段脊神经节合成增加，并转运到外
13、周肺组织，使外周肺组织N F 、S Y N 表达增加，N G F 在其中起重要作用，这为哮喘的防治探索了一条新的途径。2 R S V 病毒感染具有升高s D 大鼠c ，一T 。段脊神经节神经丝表达的 作用。腹腔注射N G F 抗体表现出N G F 抗体几乎可以完全抑制R S V 病毒感染对s D 大鼠c ，一T 。段脊神经节神经丝表达增高的作用，说明R S V 病毒感染诱导C O 0 5 ) ，B u tt h e yw e r ea 1 1s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ft h ec o u n t r o lg r
14、o u p ( p O 0 5 ) T h ec o n t e n t so fS Y Ni nt h eR S V i n o c u l a t e dg r o u p sf o r8w e e k sa n d1 2w e e k sw e r em u c hh i g h e rt h a nt h o s ei nc o u n t r o lg r o u p s ( P 0 0 5 ) T h e r ew a sn oo b v i o u sd i f e r e n c ei nt h ec o n t e n t so fN Fb e t w e e nc o u
15、n t r o lg r o u p sf o r8w e e k sa n d1 2w e e k s ( P O 0 5 ) T h ec o n t e n t So fN Fi nt h eR S V i n o c u l a t e dg r o u p sf o r8w e e k sa n d1 2w e e k sw e r em u c hh i g h e rt h a nt h o s ei nc o u n t r o lg r o u p s ( P 0 。0 5 ) T h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r
16、 e n c ei nt h ec o n t e n t so fN Fb e t w e e nR S V i n o c u l a t e dr a t sw i t hN G Fa n t i b o d yi nt h er e s p i r a t o r yt r a c ta n dc o u n t r o lg r o u p s ( P O 0 5 ) T h ec o n t e n t so fN Fw e r em u c hl o w e ri nt h ee x p e r i m e n t a lR S V i n o c u l a t e dr a t sw i t hN G Fa n t i b o d yi nt h er e s p i r a t o r yt r a c tt h a ni nt h eR S V i n o c u l a t e dg r o u p( P O 0 5 )
