《长期高盐饮食诱导Wistar大鼠血管重构的机制及替米沙坦干预论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《长期高盐饮食诱导Wistar大鼠血管重构的机制及替米沙坦干预论文（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、遵义医学院硕i ：学位论文长期高盐饮食诱导W i s t a r 大鼠f l L 管重构的机制及替米沙坦干预基因、蛋白表达减少( P 1 2 0 m m H g 7 1 。1 3 2 血压的测定尾动脉间接测压严格按照B E S N I I 多通道动物无创测压仪说明书操作。测压前提前开机3 0 分钟预热，使鼠尾循环加热系统温度达到4 2 - 4 5 “ ( 2 ，在安静、室温( 2 眦5 ) 状态下，将大鼠固定于专用的鼠盒中，鼠尾置于循环加热的可加压通道内，待大鼠处于安静状态，尾动脉压波形稳定后注气加压测量尾动脉压力，每只大鼠测量三次，取其平均值作为该大鼠该次的尾动脉压。大鼠适应性饲养一周后开始
2、测压，作为基础压，随后每两周测量一次直至取材。颈动脉直接测压实验结束后各组随机抽取6 只大鼠进行颈总动脉测压。术前禁食1 2 h ，1 0 水合氯醛按照0 3 m l 1 0 0 9 体重腹腔注射麻醉后，使大鼠仰卧固定，剪去颈部正中约2 锄3 c m范围的毛，颈部正中偏右侧切开皮肤，钝性逐层分离肌肉至颈总动脉，使用玻璃分针小心剥去血管周围神经，结扎远端血管，动脉夹夹闭近端血管，左手用镊子的柄端轻轻挑起血管，右手持眼科剪在血管上斜向剪- d , 口，然后把充满肝素的已连接聚丙乙烯小管沿小口插入血管，并结扎固定，打开动脉夹，待血压稳定5 1 0 分钟后记录血1 4遵义医学院硕士学位论文长期商盐饮食
3、诱导W i s t a r 大鼠血管重构的机制及咎米沙坦干预压值。1 3 3 给药方法将适量替米沙坦溶于适量稀释N a O H 溶液( p H 8 o 9 O ) 中【8 】，配成一定浓度的替米沙坦溶液，大鼠每周称体重两次，根据替米沙坦溶液浓度及大鼠体重计算给药量，使每只大鼠灌胃体积控制在2 3 m l 内。替米沙坦起始给药剂量为2 m g k g 体重，随后每两周测定尾动脉压一次，根据血压情况调整剂量，对照组及模型组给予相应体积的稀释N a O H 溶液( p H 8 9 O ) 灌胃，各组灌胃直至实验结束。1 3 4 标本的采集和处理各组大鼠麻醉处死后，取出主动脉及肠系膜动脉部分分支。选取
4、主动脉弓下3 m m 及肠系膜动脉第一级分支约3 m m 放于多聚甲醛中固定。其余主动脉去内膜和外膜并剪成碎片，留取5 0 m g 放于预先盛有T r i z o l 去酶E P 管中，然后在液氮中速冻后再放在8 0 。C 冰箱中保存备用，其余直接放入E P 管中在液氮中速冻并在8 0 冰箱中保存。1 3 5H E 染色组织经固定2 4 小时后，进行脱水、透明及石蜡包埋。脱蜡至水_ 苏木素染液3 - 4 分钟_ 自来水( 流水) 冲洗3 0 秒_ 1 盐酸酒精分化返兰2 3 秒_ 自来水( 流水)冲洗5 1 0 分钟一伊红染液2 分钟一自来水( 流水) 冲洗3 0 秒_ + 9 5 乙醇数秒一
5、9 5 乙醇数秒_ 无水乙醇数秒_ 无水乙醇数秒_ 烤箱烤干，6 0 3 5 分钟_ 中性树胶封片。采图及分析：使用L E I C A D M 2 5 0 0 光学显微镜照相记录图片，在4 0 0 倍镜下利用计算机辅助系统下，按照顺时针方向随机测量1 2 个主动脉动脉和肠系膜动脉中膜后，取平均值；腔径值按照“米”字形测量腔径大小，取平均值。动脉中膜厚度和腔径值每组取5 个标本，然后再取平均值，分别作为主动脉和肠系膜动脉中膜厚度和腔径。每个标本的中膜厚度的平均值和腔径的平均值的比值作为该标本的中膜厚度腔径。1 3 6M a s s o n 染色组织经固定2 4 小时后，进行脱水、透明及石蜡包埋。
6、( 1 )石蜡切片经8 5 烘烤1 h( 2 )二甲苯I 脱蜡1 0 分钟( 3 )二甲苯I I 脱蜡1 0 分钟( 4 )无水乙醇除去二甲苯3 分钟1 5遵义医学院硕士学位论文长期赢盐饮食诱导W i s t a r 大鼠血管重构的机制及替米沙坦干预( 5 )( 6 )( 7 )( 8 )( 9 )( 1 0 )( 1 1 )( 1 2 )( 1 3 )( 1 4 )9 5 乙醇1 0 秒钟8 0 乙醇1 0 秒钟5 0 乙醇1 0 秒钟蒸馏水I1 0 秒钟蒸馏水I I1 0 秒钟苏木素染液染色7 分钟自来水冲洗5 秒钟盐酸酒精分化1 0 秒钟自来水冲洗6 分钟0 5 冰乙酸冲洗1 0 秒钟(
7、 1 5 )丽春红酸性复红染色3 0 分钟( 1 6 )0 5 冰乙酸冲洗1 0 秒钟( 1 7 )1 磷钼酸1 0 秒钟( 1 8 ) 0 5 冰乙酸冲洗1 0 秒钟( 1 9 ) 2 亮绿染色2 分钟( 2 0 )5 8 烤箱烘烤5 分钟( 2 1 )中性树胶封片采图及分析：使用L E I C AD M 2 5 0 0 光学显微镜照相记录图片，M a s s o n 染色能够使主动脉和肠系膜胶原纤维染成绿色，胞浆染成红色。在4 0 0 倍镜下利用计算机辅助系统，每张切片随机取5 个图像测量主动脉和肠系膜中膜内胶原纤维面积的百分比，每组在取5 个标本测动脉中膜胶原纤维面积百分比，并取平均值作
8、为该组动脉中膜胶原纤维面积百分比。1 3 7 主动脉平滑肌组织匀浆液的制备取出冻存主动脉平滑肌组织在冰水浴中解冻，用干净的镊子取出置滤纸上吸干水分，在电子天平上称重后放入手动玻璃匀浆器中，按质量体积比1 ：9 加入冰冷的生理盐水，将捣杆垂直插入匀浆管中上下转动充分碾磨( 冰上操作) ，直至组织匀浆化，2 5 0 0转分，4o C ，离心1 0 分钟，取出上清液按1 ：4 比例加入N S 稀释，分装到3 个0 5 m l的E P 管中- 8O 低温冰箱保存，用于检测蛋白浓度、A n g l I 含量、醛固酮含量、酶活性的检测。1 6遵义医学院硕 二学位论文长期岛盐饮食诱导W i s t a r
9、人鼠m 管重构的机制及替米沙坦干预1 3 8 主动脉平滑肌组织匀浆液蛋白浓度的测定用考马斯亮兰法测定匀浆液蛋白的浓度，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。测定原理：蛋白质分子具有N H 3 + ，当棕红色的考马斯亮蓝显色剂加入蛋白标准液或样品中时，考马斯亮蓝染料上的阴离子与蛋白N H 3 + 结合，使溶液变成蓝色，通过测定吸光度可计算出蛋白含量。通过7 2 1 型分光光度计在波长5 9 5 n m 处，l c m 光径比色测得各管吸光度值( O D 值) ，以( 测定管O D 值一空白管O D 值) ( 标准管O D 值一空白管O D 值) 乘以标准蛋白浓度得出。1 3 9 主动脉平滑肌组织匀
10、浆液A n gI I 含量的测定标本由8 0 冰箱取出后，冰上解冻。采用放射免疫分析法测定A n g I I 水平，严格按照北京科美东雅生物技术有限公司A n g I I 放免试剂盒说明书操作。组织A n gI I 浓度= 匀浆组织A n g I I 浓度该组织匀浆蛋白浓度，单位为p g m g p r o 。1 3 1 0 主动脉平滑肌组织匀浆液醛固酮含量的测定标本由8 0 冰箱取出后，冰上解冻，采用放射免疫法测定醛固酮水平，严格按照北京北方生物技术研究所放醛固酮免试剂盒说明书操作。组织醛固酮浓度= 匀浆组织醛固酮浓度该组织匀浆蛋白浓度，单位为p g m g p r o 。1 3 1 1 主
11、动脉平滑肌组织中A T P a s e 活性的测定用酶学比色法测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，严格按试剂盒说明书操作。根据A T P a s e 可分解A T P 成A D P 和无机磷( P i ) ，测定P i 的量可判断A T P a s e活力的高低，A T P a s e 活性以每毫克总蛋白中A T P a s e 每小时分解A T P 产生的P i ( I - t m 0 1 )的量表示, 0 t m o l P i h “ 1 m g p r l ) 反应产物用7 2 1 型分光光度计在波长6 6 0 n m 处，l e n a 光径，蒸馏水调零测各管吸光度O D 值，
12、最后计算反应后样品中的磷含量，即为A T P a s e活性。计算公式如下：A T P a s e 活性- - ( N 定管O D 值对照管O D 值) 标准管O D 值标准管磷含量X 反应体系中样品稀释倍数x 6 匀浆蛋白的浓度；C a N 活性= ( 测定管O D值对照管O D 值) ( 标准管O D 值标准空白管O D 值) 标准管磷含量反应体系中样品稀释倍数3 匀浆蛋白的浓度。1 3 1 2 实时定量逆转录聚合酶链反应( R e a l - t i m eP C R ) 检测主动脉平滑1 7遵义医学院硕 ：学位论文长期商盐饮食诱导W i s t a r 大鼠血管重构的机制及替米沙坦干预
13、肌组织中A T l R 、A T 2 R 、P M C A l 和钠泵Q l 亚单位的表达总R N A 提取( 1 )匀浆：将冷冻保存于l m l T r i z o l 中的样本，于冰上使用研磨棒充分匀浆。( 2 )萃取：加入5 0 0 p 1 氯仿，剧烈震荡摇匀，4 “ C ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 分钟，取上清。( 3 )沉淀：加入与上清等量的异丙醇，轻摇匀，4 “ C ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清。( 4 )洗涤：加入7 5 酒精，轻轻将沉淀弹起，4 ，1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，弃上清，倒扣于滤纸上空干。( 5
14、)溶解：加D E P C 水5 0 山溶解。R N A 纯度测定及定量( 1 ) 取1 0J t l R N A 样本和4 9 0 p I D E P C 水于石英比色皿中用枪吹打混匀，以D E P C 处理水为空白对照管，在紫外分光光度计上分别测定其2 6 0 n m 和2 8 0 h m 的O D值。R N A 样品的浓度= O D 2 6 0 x 4 0 n g I _ d x 稀释倍数。O D 2 6 0 O D 2 8 0 在1 8 呲2 0 之间认为纯度符合要求。( 2 ) 4 0 V 15 0n g v I R N A 样本的配置：依据公式4 0 x 5 0 R N A 样品浓度
15、，计算出所需R N A 样本的体积，再用D E P C 处理水补足至4 0 J t I ，即得用于逆转录所需的T 0 t a lR N A 液。逆转录( 1 ) 反应体系组成( 反应总体积1 0 1 上1 )1 5x P r i m e S c r i p tB u f f e rP r i m e S c r i p tR TE n z y m eM i x IO L i g od TP r i m e rR a n d o m6m e l ST o t a l R N A( 2 ) 反应条件第一阶段：3 7 1 5 分钟第二阶段：8 5 5 秒第三阶段：迅速降温至4 “ C2 山0 5 “
16、l0 5 “l0 5 p l6 5 山遵义医学院硕上学位论文长期高盐饮食诱导W i s t a r 大鼠血管重构的机制及替米沙坦干预r e a l - ti m eP C R( 1 ) 反应体系组成S Y B RP r e m i xE xT a g7 5 1 x l DEPC水41xl引物( 上游、下游引物)O 5 1 x l稀释5 倍的e D N A3 山( 2 ) 反应条件p - a c t i n 反应条件第一步：预变性9 5o C x 8 5 m i n第二步：变性9 5o C x l 5 s退火延伸5 7 1o C x 2 0 s第二步共循环4 0 次。A T l R 、A T 2 R 反应条件第一步：预变性9 5o C x 8 5 m i n第二步：变性9 5o C x l 5 s退火延伸6 0 7 0 C x 2 0 s
