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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 基因在心脏发育中蛋白表达下调作者：倪秋明，章佳颖，来丹丹，褚茂平，王赛斌，黄晓燕，张怀勤，杨德业 作者单位：温州医学院附属第一医院 心血管内科，温州医学院 心血管生物和基因研究所，浙江 温州 325000【摘要】 目的:观察 Pax-8 基因在 ALK3 基因敲除小鼠心脏中的蛋白表达情况，探讨 Pax-8 基因在心脏发育中的作用。方法:基因芯片(microarray)和定量逆转录-聚合酶链反应测定 ALK3 基因的下游基因，免疫组化法检测 13.5 d 小鼠胚胎心脏特异性 ALK3 基因敲除小鼠胚胎中 Pax-8 蛋白的表达，连续病理切片及 HE 染色
2、观察刚出生的 Pax-8 基因敲除小鼠的心脏形态。结果：在心脏特异的ALK3 基因敲除小鼠中，转录因子 Pax-8 基因 mRNA 的表达水平上被下调 7.1 倍。免疫组化结果显示：13.5 d 小鼠胚胎心脏特异性 ALK3 基因敲除的纯合子小鼠 Pax-8 基因在蛋白水平与杂合子相比也明显下调。Pax-8 基因敲除小鼠纯合子有明显的室间隔和左心室肥厚，心脏呈球形。结论:Pax-8 基因是 ALK3 基因的下游基因，与心脏发育有密切关系。【关键词】 Pax-8 基因;室间隔缺损; 免疫组化;蛋白表达Down-regulated protein expression level of Pax-8
3、 gene during heart development in mice NI Qiu-ming，ZHANG Jia-ying，LAI Dan-dan，CHU Mao-ping，WANG Sai-bin ，HUANG Xiao-yan，ZHANG Huai-qin，YANG De-ye. Department of Cardiology， the First KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Hospital & Institute of Cardiovascular Biology & Gene， Wenzhou Medical College， Wenzhou，325000Ab
4、stract: Objective: To investigate the level of Pax-8 protein expression in the condi-tional ALK3 kockout mice heart and study the role of Pax-8 gene in the cardiac development. Methods: The microarray and real time quantitative RT-PCR were used to investigate the down-stream genes of ALK3. Immunohis
5、tochemical technology was used to detect the level of Pax-8 protein expression in the 13.5 d heart derived from a-MHC Cre+/-，ALK3 F/- and a-MHC Cre+/-，ALK3 F/+ mice. To study the contribution of Pax-8 gene in the cardiac development，the heart derived from pax-8 kockout mice was overviewed using cons
6、ecutive pathological section and HE staining method. Results:The level of Pax-8 mRNA expression was down-regulated 7.1 fold in the embryonic heart (11.5 days) of a-MHC Cre+/-，ALK3 F/-. The level of Pax-8 protein expression was also remarkably down-regulated in the embryonic heart (13.5 days) of a-MH
7、C Cre+/-，ALK3 F/-. The heart of pax-8 KO-/-mice became spheroidal，the left ventricle enlarged， left ventricular wall and interventricular septum thickened， papillary muscles in the left ventricle enlarged. Conclusion: Pax-8 gene is the cardiac-specific ALK3 downstream gene. Pax-8 may play important
8、roles in the cardiac development.Key words: Pax-8 gene;ventricular septal KKME-专业医学搜索引擎 http:/ ;protein expression先天性室间隔缺损的发病机制尚不十分清楚。近年来，美国 Schneider 教授使用 a-MHC Cre+loxP 系统1(心脏特异性敲除系统)对心脏 ALK3 基因进行特异性地敲除，ALK3 基因敲除的纯合子小鼠死于胚胎中期，并有室间隔缺损、心内膜垫和肌小梁发育不良2。然而，ALK3 基因是与心脏发育有关的比较上游的基因。为了研究ALK3 下游的并有心脏特异性的基因，在
9、 ALK3 基因敲除和 Pax-8基因敲除小鼠模型上，观察 Pax-8 基因在心脏中的蛋白表达情况，以探讨 Pax-8 基因在心脏发育中的作用。1 材料和方法1.1 动物 20 只 a-MHC Cre +/-、ALK3+/-(a- MHC 为启动子的 Cre 重组酶转基因杂合子，ALK3 系统基因敲除的杂合子小鼠)和 20 只 ALK3 F/F(在 ALK3 基因第 2 个外显子两端插入 lox P 序列的小鼠)的 C57 小鼠(由美国 Schneider 教授提供) 交配，可得到在心脏纯合子 ALK3 基因敲除(a-MHC Cre +/- 、 ALK3 F/-)的小鼠胚胎和杂合子 ALK3
10、基因敲除(a-MHC Cre +/- 、ALK3 F/+)的胚胎。 Pax-8基因敲除的纯合子小鼠(Pax-8 KO -/-)和 Pax-8 基因敲除的杂合子小鼠(Pax-8 KO +/-)由德国 Gruss 和 Mansouri 教授惠赠。1.2 总 RNA 的提取 首先收集试验组和对照组的 11.5 d 小鼠的胚胎心脏，然后用总 RNA 试剂盒( 美国 QIAGEN 公司生产)提取和纯化总 RNA。1.3 基因芯片3 德国生产的 25 000 个小鼠基因的基因芯KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 11.5 d 小鼠胚胎心脏总 RNA。 试验组的总 RNA来自 a-MHC Cre +/
11、-、ALK3 F/-的 11.5 d 小鼠胚胎心脏，对照组的总RNA 来自 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+ 的 11.5 d 小鼠胚胎心脏。1.4 定量逆转录-聚合酶链反应4 Taq Man 一步法聚合酶链反应试剂盒(美国 Perkin-Elmer 公司生产)被用于定量 RT-PCR。每个PCR 反应孔使用 100 ng 的总 RNA。试验组的 RNA 来自 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-的 11.5 d 小鼠胚胎心脏，对照组的 RNA 来自 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+的 11.5 d 小鼠胚胎心脏。cDNA 合成的条件是 48 、30 min。c
12、DNA 经过 40 个 PCR 周期被扩增。在 PCR 扩增前首先用 95 、10 min 使 cDNA 变性。每个 PCR 周期由 95 、15 s(变性)加上 60 、1 s(退火+延伸)。每种 RNA 同时做 3 个条件完全相同的 PCR 反应孔。所有 PCR 有效性在 95%以上。ABI PRISM 7700 序列检测仪(美国 Perkin-Elmer 公司生产)被用于定量 RT-PCR的检测。转录因子 Pax-8 的荧光素探针序列是：6 FAM-TGT CCC CAG TGT CAG CTC CAT CAA CA-TAMRA。Pax-8 的正向引物序列是：5-CAG AAG GCG
13、TTT GTG ACA ATG A- 3。Pax-8 的逆向引物序列是：5-GCA CTT-TGG TCC GGA TGA TT-3。定量 RT-PCR内部对照基因 36B4 的荧光素探针序列是：6FAM-CCA GGC TTT GGG CAT CAC CAC G-TAMRA。36B4 的正向引物序列是： 5-GGA CCC GAG AAG ACC TCC TT-3。36B4 逆向引物序列是： 5-TCA ATG GTG CCT CTG GAG ATT-3。1.5 免疫组化染色 试验分 A、B、C、D 四组，A 组(试验KKME-专业医学搜索引擎 http:/ a-MHC Cre +/-、AL
14、K3 F/-(纯合子)小鼠胚胎 6 只，B 组(对照组) 为a-MHC Cre +/-、 ALK3 F/+(杂合子)的小鼠胚胎 6 只，C 组( 阴性对照组)为 Pax-8 KO -/-(纯合子 )6 只，D 组(阳性对照组 )为刚出生正常C57 小鼠 6 只。取 13.5 d a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)和 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+(杂合子)以及 13.5 d 的 Pax-8 KO-/-(纯合子)的小鼠胚胎心脏，刚出生 C57 小鼠取甲状腺组织。免疫组化采用SABC 法，具体步骤参照免疫组化试剂盒 (Proteintech 生物技术有限公司生产)
15、说明书。免疫组化染色图片每张切片光镜下放大 400 倍，随机抽取 35 个视野，用 Advanced spot 拍照系统进行拍照保存。应用 IPP 分析软件测定图片的累计光密度值(OD 值)。1.6 HE 染色 试验组为 19.5 d(刚出生)Pax-8 KO -/-(纯合子)的小鼠，对照组为 19.5 d(刚出生)Pax-8 KO +/-(杂合子)的小鼠，按常规做四腔心切片，切片厚度约 3 m，切片用 HE 法染色来观察心脏大体形态。HE 染色图片，在光镜下放大 20 倍，直接观察，拍照。1.7 统计学处理方法 采用 SPSS13.0 统计软件，多组之间均数的两两比较采用 SNK-q 检验。2 结果2.1 心脏特异 ALK3 基因敲除小鼠的获得 雌的 -MHC Cre +/-、ALK3 +/- 和雄的 ALK3 F/F (在 ALK3 基因第二外显子两边插入 Lox P 的片段) 交配可获得 -MHC Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)和 -MHC Cre +/-、ALK3 F/+(杂合子) 的小鼠胚胎。2.2 Pax-8 基因敲除小鼠的获得 雌的 Pax-8 KO +/- 和雄的KKME-专业医学搜索引擎 http:/ KO +/-交配可获得 Pax-8 KO -/-(纯合子) 和 Pax-8 KO +/-(杂合子)。2.3
