《GSK3β在乳腺癌细胞系中的表达及其与P38MAPK相关性的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《GSK3β在乳腺癌细胞系中的表达及其与P38MAPK相关性的研究（40页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、四五、参考文献2 3六、附录综j 苤2 5在校期间科研成绩3 6致谢3 7个人简介3 8中文论著摘要G S K 3 p 在乳腺癌细胞系中的表达及其与P 3 8 M A P K相关性的研究刖吾G S r 3 p 是糖原合成激酶3 ( g l y c o g e ns y n t h e s i sk i n a s e ，G S K - 3 ) 的亚型之一。近年来越来越多的研究证实，G s r 3 p 不仅仅参与糖原代谢过程，它更是一个多功能激酶，在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化、细胞运动以及肿瘤发生等方面都扮演了重要角色。近来研究发现，G S 飚D 在乳腺癌的发生发展过程中起到了重要作用，并参与
2、了乳腺癌细胞生长和细胞凋亡信号通路调控。但是，G S K 3 1 3 是否参与了乳腺癌细胞的转移仍然是个有待于研究的问题。p 3 8 M A P K 是丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，M A P K ) 家族的重要成员。最近，p 3 8 M A P K信号通路因以正性调节的方式参与肿瘤的侵袭转移过程而倍受关注。为此，本研究检测了p - p 3 8 ，p - G S K 3 1 3 湖9 ，G s r , 3 p 在乳腺癌细胞系中的表达情况，并进一步研究6 s r , 3 p 在乳腺癌侵袭中的
3、作用以及G S r , 3 p 和p 3 8 M A P K 通路的关系，为乳腺癌治疗提供相应的理论依据。材料与方法1 、材料( 1 ) 细胞系人乳腺癌细胞系M C F 7 ，M D A M B 2 3 1 ，M D A M B 4 3 5 s ，原购自北京协和基础医学院细胞中心，本实验由中国医科大学已有的细胞复苏而得。( 2 ) 主要试剂鼠抗人p - p 3 8 抗体购自C e l ls i g n a l i n g 公司。兔抗人G S K 3 1 3抗体购自B i o w o r l d 公司。兔抗人p - G S K 3 1 3 8 种抗体购自S a n t a 公司。p 3 8 M
4、A P K 特异性抑制剂S B 2 0 3 5 8 0 购自美国C a l b i o c h e m 公司。G S K 3 1 3 特异性抑制剂S B 2 1 6 7 6 3购自C a y m a n 公司。T r a n s w e l l 小室( 孔径8 u r n ) 购自C o m i n g 公司。2 、方法( 1 ) W e s t e r n 印迹法收集细胞加入R I P Ab u f f e r 裂解液，超声处理，高速低温离心提取总蛋白，用B r a d f o r d 法进行蛋白浓度测定。S D S P A G E 电泳，转印，封闭后加相应一抗、二抗。E C L 发光，观察
5、拍照，进行灰度值测定。( 2 ) 免疫荧光染色取对数生长细胞接种到孔板中。固定、T r i t o n X 1 0 0 处理、封闭后加相应一抗、二抗，复染细胞核，荧光显微镜观察拍照。( 3 ) T r a n s w e l l 实验T r a n s w e l l 小室接种细胞后培养，擦去上室内细胞后固定，染色，观察拍照，进行细胞计数。3 、统计学分析应用S P S S l 3 0 统计软件行数据处理：采用t 检验分析W e s t e r nB l o t 图像灰度值、T r a n s w e l l 穿膜细胞数，用L S D t 检验对各样本均数行两两比较，P 0 0 5 ) ( 2
6、 ) M D A M B - 4 3 5 sc e l l sI m m u n o f l o r e s c e n c es h o w s ：P p 3 8m a i n l yl o c a l i z e di nn u c l e u sa n dm a n i p u l u si nc y t o p l a s m p - G S I Op 5 哪m a i n l yl o c a l i z e di nc y t o p l a s ma n dm a n i p u l u si nn u c l e u s 62 T h ec h a n g e so f M D
7、 A M B 4 3 5 sd e a l e dw i t hL i C La n dS B 216 7 6 3 ，t h ei n h i b i t o ro fG S K 36 ( 1 ) T h eM D A - - M B - 4 3 5 sc e l l sw h i c hw e r ei n c u b a t e dw i t hL i C La n dS B 2 0 3 5 8 0i n c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no fp G S K 3 1 3 蚶9 ( 尸 O 0 5 ) ( 2 ) C e l l sI m m u n
8、 o f l o r e s c e n c es h o w s ：t h ec y t o p l a s mp - O S K 3p 8 c r 9d e c r e a s e da sw e l la sa ni n c r e a s eo fn u c l e u sp - G S K 31 3 r 9 ( 3 ) T h eS B 216 7 6 3p r o m o t e dt h ep o t e n t i a lo fi n v a s i o na n dm i g r a t o r yo fM D A M B - 4 35 s 谢t I lad o s e d
9、e p e n d e n tm a n n e r ( 尸 0 0 5 ) 。( 2 ) 选取p - p 3 8 ，P G S K 3 1 3 s e t 9 均高表达的高侵袭高转移细胞系M D A M B 一4 3 5 s ，免疫荧光定位显示：p - p 3 8 在M D A M B 4 3 5 s 中主要表达在细胞核，细胞浆中仅有微弱的表达；而p G S 飚p 5 羽在M D A M B 4 3 5 s 中主要表达在细胞浆，细胞核中仅有微弱的表达( 图2 ) 。H o e c h s tp - C i s K 3 p 一M e r g e图2 ，p - p 3 8 和p G S K 3
10、p 丹在M A D M B 4 3 5 s 细胞系中的表达情况( 4 0 0 )A 、D ：H o e c h s t 标记细胞核显示蓝色荧光。B ：F I T C 标记的p - p 3 8 蛋白显示绿色荧光；E ：T R I T C 标记的p - G S K 3 3 5 哪显示红色荧光。C 、F ：为合成图。2 、G S K 3J 3 抑制剂L i C L 和S B 2 1 6 7 6 3 M D A M B 4 3 5 s 作用细胞系后观察各指标改变1 4( 1 ) W e s t e r nb l o t 显示，使用G S K 3 p 抑制剂L i C L ( 1 0 m m o l L
11、 ) 和S B 2 1 6 7 6 3( 2 0 u m o l L ) 作用M D A M B 4 3 5 s 细胞系2 4 h 后( 分别以N a C L 和D M S O 为对照组) ，与对照组相比，p - G S K 3 3 8 唧表达均上调，G S K 3 p 无明显变化，表明p - G S K 3 1 3 8 砷表达的上调使G S K 3 1 3 活性减弱( 图3 ) 。 喜c皤 伊N a f LL i C l D M S OS B 2 1 6 7 6 3 p - G S K 3 3 神- - 。- _ 4 7 K DG S K 3 1 3 。- 4 7 K D1 3 - a c
12、t i n - - - - - - - - 4 2 K DAO O0C图3 ，加入G S K 3 p 抑制剂L i C L 和S B 2 1 6 7 6 3 作用M D A M B 4 3 5 s 细胞系后p - G S K 3 1 3 8 哪、O S r d p 的表达情况A ：W e s t e r nb l o t 显示p - G S K 3 1 3 5 唧、G S K 3 1 3 蛋白在M D A - M B 一4 3 5 s 中的表达，以1 3 - a c t i n 为内参；B ：显示p G S K 3 1 3 s c r 9 、G S K 3 1 3 蛋白与p a c t i n
13、 E g 较后的相对表达量。可见实验组( L i C L 组) 与对照组( N a C L 组) 相比，p - G S K 3 1 3 5 唧表达增加( 尸 O 0 5 ) 。C ：显示p - G S K 3 1 3 5 哪、G S K 3 1 3 蛋白与1 3 一a c t i n L L 较后的相对表达量。可见实验组( S B 2 1 6 7 6 3 组) 与对照组( D M S O 组) 相比，p G S K 3 p 8 唧表达增加( P 0 0 5 ) 。( 2 ) 免疫荧光定位显示：使用G S K 3 1 3 抑制剂S B 2 1 6 7 6 3 ( 2 0 u r n o l L
14、) 作用M D A ，M B - 4 3 5 s 细胞系2 4 h 后( 以D M S O 为对照组) ，实验组与D M S O 组相比，p G S K 邛刚胞浆表达减少，核表达增多。表明S B 2 1 6 7 6 3 可以促进p G S K 3 p 8 砷由胞浆到胞核的移动。( 图4 )1 5H o e c h s tp - G S K 31 33 。r 9M e r g elllD M S 0S B 2 1 6 7 6 3图4 ，S B 2 1 6 7 6 3 作用M D A - M B 4 3 5 s 细胞系2 4 h 后，p G S K 3 p 刚表达情况( 4 0 0 )A ：D M
15、 S O 对照组，H o e c h s t 标记细胞核显示蓝色荧光。B ：D M S O 对照组，T T C 标记的p G S K 邛刚显示红色荧光。可见p G S K 3 1 3 8 融在M D A M B 4 3 5 s 中主要表达在细胞浆，细胞核中仅有微弱的表达；C ：S B 2 1 6 7 6 3 组；H o e c h s t 标记细胞核显示蓝色荧光。D - S B 2 1 6 7 6 3 组；T R I T C 标记的p G S K 3 1 3 s e r 9 显示红色荧光。可见p G S K 3 1 3 刚在M D A M B 4 3 5 s 的核表达增多，浆表达减少。E 、F ：为合成图。( 3 ) T r a n s w e l l 实验检测细胞对人工重组基底膜的侵袭能力：4 0 0 倍光镜下任意选取3 0 个视野，进行计数，比较不同浓度的G S K 3 1 3 抑制剂S B 2 1 6 7 6 3 作用M D A M B 4 3 5 s 细胞系2 4 h 后穿过人工基底膜的细胞数( 个视野) ，在S B 2 1 6 7 6 3浓度为0 ，5 ，1 0 ，2 0 u m o l L 时分别是：1 1 8 0
