《高甘油三酯血症对大鼠胰腺腺泡细胞损伤机制的实验研究硕士论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高甘油三酯血症对大鼠胰腺腺泡细胞损伤机制的实验研究硕士论文（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、复旦大学硬士研究生论文高甘油三醋盎症对太鼠接隙艨泡细胞损伤辊翻韵实验研究高甘油三酯血症对大鼠胰腺腺泡细胞损伤机制的实验研究中文摘要研究目的：高甘油三酯血症( h y p e r t r i 9 1 y c e r i d e m i a ，H T G ) 是急性胰腺炎的发病诱因之一，目前其机制尚未完全阐明。本研究通过饮食诱导建立高甘油三酯血症大鼠模型，并且原代分离培养大鼠胰腺腺泡细胞，观察H T G 对大鼠胰腺腺泡细胞形态、酶分泌功能、细胞凋亡和细胞内钙离子水平的影响，旨在探讨H T G 对大鼠胰腺腺泡细胞的损伤机制，并为阐述高甘油三酯血症性胰腺炎的发病机制提供部分实验依据。研究方法：1 、断
2、奶一周雄性s D 大鼠随机分为高脂饮食组和正常饮食组，每组1 0 只，分别给予商脂饲料和正常饲料喂养四周。测定血浆甘油三酯( t r i g l y c e r i d e ，T G ) 、胆固醇( c h o l e s t e r o l ，T c ) 及游离脂肪酸( f r e ef a t t ya c i d ，F F A ) 水平，光镜、透射电镜下观察胰腺腺泡细胞形态。2 、胶原酶消化法分离高脂饮食组和正常饮食组大鼠胰腺腺泡细胞，台盼兰拒染法检测细胞活力。给予八肽胆囊收缩索( c h o l e e y s t o k i n i n - o c t o p e p t i d e
3、 ，C C K 一8 ) 刺激胰腺腺泡细胞，测定淀粉酶和乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ，I 。D H ) 释放比例。透射电镜下观察C C K 一8 对胰腺腺泡细胞形念学的影响。逆转录聚合酶链式反应( R T P C R ) 法检测胰腺腺泡细胞受到C C K 一8 刺激后凋亡相关基因b c l 一2 和b a x 的表达变化。3 、采用特异性钙离子荧光探针( F l u o 一3 一A M ) 染色，激光共聚焦扫描显微镜测定C C K 一8 及内质网膜钙一A T P 酶抑制剂T h a p s i g a r g i n ( T p
4、g ) 对胰腺腺泡细胞内钙离子荧光强度的影响，间接反映细胞内钙离子浓度的变化。研究结果：l 、高脂饮食四周后大鼠血浆T G 和F F A 水平较正常饮食组明显升高( P ( O 0 5 ) ，T C与正常组相比无明显差异( 乃0 0 5 ) 。光镜、电镜下观察发现高脂饮食组大鼠复巨大学硕士研究生论文商甘油三酶电蛙对大鼠驶隙隙泡细瞻掼伤机截的宴验研究胰腺腺泡细胞出现空泡样改变和内质网扩张。2 、体外细胞活力实验显示，体外培养3 h r 内，高脂饮食组与正常饮食组细胞活力无明显差异( 乃O 0 5 ) 。随着体外培养时间的延长，高脂饮食组细胞活力下降更为明显。体外培养6 h r 后，高脂饮食组细胞
5、活力明显低于对照组( K 0 0 5 ) 。3 、淀粉酶和L D H 分泌实验结果表明，高脂饮食组大鼠胰腺腺泡细胞受到C C K 一8刺激后，淀粉酶和L D H 释放比例均高于正常饮食组( P O 0 5 ) ：而2t lm o l LT p g刺激胰腺腺泡细胞，两组细胞内钙荧光强度变化峰值接近( D O 0 5 ) 。应用无钙细胞外液时，2um o l LT p g 刺激胰腺腺泡细胞，高脂组钙荧光强度上升峰值较正常组增高，但未达到统计学差异( 乃0 0 5 ) 。不论是用l O n m o l LC C K 8还是2um o l LT p g 作为刺激剂，高脂组钙荧光强度下降均较正常组缓慢，
6、并且在较长时间内维持较高水平( P 1 1 3 m m o l L ) 的升高，发生急性胰腺炎的危险性也迅速上升“1 。尽管如此，高甘油三酯血症性胰腺炎的发病机制至今尚未阐明。目前推测高甘油三酯血症导致急性胰腺炎的可能机制包括：1 、T G 分解产物对胰腺腺泡细胞的直接损伤：N a g a i 等“1 通过蛋氨酸”s 标记胰腺腺泡细胞蛋白质并测定其释放量来衡量胰腺腺泡细胞的损伤程度。在细胞培养液中同时加入含有胰脂肪酶的大鼠胰腺匀浆及T G 悬浊液后，3 5 S 测定值明显升高，证实脂肪酶与其底物T G 结合后可以对胰腺腺泡细胞造成明显损伤。显然这种病理损伤与T G 分解产物密切相关。2 、胰蛋
7、白酶原激活加速：生理情况下，胰蛋白酶原在胰腺腺泡细胞粗面内质网合成后被输送到高尔基复合体，再经浓缩泡浓缩，最后浓缩的酶原与细胞膜融合，借助胞吐作用，将酶原释放至胰导管内。由于正常情况下胰蛋白酶以非活化的酶原形式释放，同时胰液中存在胰蛋白酶抑制剂，胰腺组织不出现自我消化现象。H T G 时，T G 分解产物F F A 增多诱发酸中毒，激活胰蛋白酶原，进而引起腺泡细胞自身消化，加重胰腺炎的病理损害”1 。3 、胰腺微循环障碍：高T G 血症时血液粘稠度增加，T G 代谢产物F F A 可以引起胰腺毛细血管内皮细胞损伤，导致胰腺微循环障碍，甚至形成微血栓，最终胰腺组织缺血坏死。近来研究发现高脂饮食可
8、以导致细胞膜和细胞器膜中脂肪酸含量及其构成比例发生变化，并因此影响信号转导过程，引起细胞内钙异常增高，影响细胞功能”、。钙离子是细胞内重要的第二信使，参与调控细胞众多生理功能和代谢过程。随着研究的不断深入，人们发现急性胰腺炎时胰腺腺泡细胞内钙离子异常增高可能是急性胰腺炎发生的原因。研究发现细胞内长时间钙离子浓度升高能够激活胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原，促进酶原空泡的形成，导致细胞自身消化引起细复E 大学硕士研究生论文高甘油兰酶血症对大鼠麟骧猿拖细瞻强扬帆翻的实验研究胞凋亡和坏死“”1 。应用细胞内钙离子螯合剂能够抑制钙离子浓度异常增高和胰蛋白酶原的激活。基于此，本研究通过建立高甘油三酯血症大鼠模型
9、，初步探讨了高甘油三酯血症对大鼠胰腺腺泡细胞的损伤作用及其可能机制。本研究包括三个部分，第一部分通过饮食诱导建立高甘油三酯血症大鼠模型，观察大鼠姐脂指标及胰腺腺泡细胞形态学变化；第二部分通过原代分离大鼠胰腺腺泡细胞，并用C C K - 8 体外刺激，从细胞外分泌功能、形态学及细胞凋亡方面检测高甘油三酯血症对细胞的损伤作用；第三部分应用激光共聚焦扫描显微镜和特异性钙离子荧光探针，动态观察C C K 一8 及T p g 引起的胰腺腺泡细胞内钙离子浓度变化，初步探讨细胞内钙浓度的异常增高在高甘油三酯血症性胰腺炎的发病中可能起到的作用。复旦六学硬士研究生论文高甘油三醣m 症对大鼠驶豫隙泡细魄损伤帆翻的
10、实验研究第一部分高甘油三酯血症大鼠模型的建立引言高甘油三酯血症是一类发病率高，危害人类健康的脂质代谢异常疾病。研究发现高甘油三醑血症时炎症因子如肿瘤坏死因子a ( t u m o rn e c r o s i Sf a c t o ra ，T N F 一) 、白介素6 ( i n t e r l e u k i n6 ，I L 一6 ) 和C 反应蛋白( Cr e a c t i r ep r o t e i n ，C R P ) 等表达增高，炎症反应增强；氧自由基生成增多引起血管内皮损伤；纤维蛋白原、活化的因子和纤溶酶原活化因子抑制剂一1 ( p l a s m i n o g e na c
11、 t i v a t o ri n h i b i t o r1 ，P A I 一1 ) 水平增高，组织纤维蛋白溶酶原激活剂( t i s s u ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r ，T P A ) 水平降低，凝血系统被激活，机体处于高凝状态，加速了动脉粥样硬化、肾脏病等多种疾病的进展“。近来人们认识到以甘油三酯增高为主的I 、和V 型( F r e d r i c k s o n 分型) 高脂血症与急性胰腺炎的发病密切相关。当血浆甘油三酯超过1 1 3 m m o l L ，则发生急性胰腺炎的危险性明显上升“1 。此类急性胰腺炎与胆固醇升高关系不
12、大，因此被称为高甘油三酯血症性胰腺炎。目前高甘油三酯血症性胰腺炎的发病机制尚未完全阐明，本研究旨在通过饮食诱导建立高甘油三酯血症大鼠模型，并探讨高甘油三酯血症对大鼠胰腺腺泡细胞的影响。材料与方法、实验材料：动物：断奶一周雄性S p r a q u e D a w l e y 大鼠，体重约7 0 9 ，购自上海市斯莱克实验动物有限责任公司( 上海市实验动物合格证书S C X K 沪2 0 0 3 0 0 0 3 ) ，于本院动物实验中心饲养。饲养环境为清洁级，按照我国实验动物饲养环境要求，保持饲养环境通风良好，温度保持2 0 。C 2 9 。C ，湿度适宜，室内明暗交替各1 2 小时。实验大鼠自
13、由进食和饮水，3 4 只笼饲养。实验试剂仪器及来源见表卜1 和表1 2 ：9复垦大学碛士研究生论文高甘油三蘸盘疰对大鼠映粮豫泡纲瞻损伤枫翻拍实验研究表卜l 主要实验试剂主要试剂试剂来源胆固醇游离脂肪酸试剂盒国药集团化学试剂有限公司南京建成生物工程研究所表卜2 主要实验仪器主要仪器仪器来源全自动生化分析仪光学显微镜E p p e n d o f f 低温超速离心机透射电子显微镜B a y e rA d v i a1 6 5 0 ，德国O l y m p u s ，日本E p p e n d o f f 公司，德国P h i l i pC M l 2 0 ，荷兰二、动物分组、模型制各及鉴定：1 、
14、动物分组及模型制备：实验选用断奶一周雄性s D 大鼠，约7 0 9 。所有大鼠以普通饲料喂养一周后，随机分为两组，每组1 0 只，分别给予高脂饲料和普通饲料继续喂养4 周。高脂饲料配方：7 7 普通饲料( w w ) 、2 0 猪油( w w ) 和3 胆固醇( w w ) 。普通饲料中含水分约1 0 ( w w ) 、粗脂肪约5 ( w w ) 、粗蛋白约2 0 ( v w ) 、粗纤维约5 ( w w ) 。配制高脂饲料时先将猪油加热溶化，再加入普通饲料和胆固醇，搅拌均匀。所有大鼠在制模结束后处死并收取标本，处死前夜八点后禁食不禁水，第二天早八点处死。采用1 戊巴比妥钠3 0 m g K
15、g 体重腹腔注射麻醉，剖腹后观察胰腺大体形态，留取血液和胰腺组织标本。部分胰腺组织固定于1 0 甲醛溶液用于H E 染色，部分胰腺组织4 。C 固定于2 戊二醛P B S 固定液中用于透射电镜观察。2 、动物模型鉴定：( 1 ) 、血浆甘油三酯、胆固醇测定：大鼠麻醉剖腹后于腹主动脉处取血，利用全自动生化分析仪采用酶法测定血浆甘油三酯、胆固醇含量。( 2 ) 、血浆游离脂肪酸测定：腹主动脉处取血，按照游离脂肪酸试剂盒说明，采用比色法测定血浆游离脂肪酸水平。( 3 ) 、苏木紫伊红染色( H E 染色) ：1 0 甲醛溶液固定大鼠胰腺组织，石蜡包埋组织，切片后行H E 染色。光镜下观察胰腺组织病理
16、改变。( 4 ) 、透射电镜：取材：迅速取下胰腺组织，用预冷的锋利刀片切成l m m l m m l m m大小组织块前固定：2 戊二醛P B S 固定液固定2 小时4 漂洗：P B S 缓冲液洗涤二次，每次1 0 分钟4 1 0复曼大学碗士研究生论文赢臼油三醣血症对大鼠聩豫稼拖细齄损伤机翻的实验研究后固定：漂洗：脱水：置换：浸透：1 锇酸P B S 固定液固定2 小时4 P B S 缓冲液洗涤二次，每次l O 分钟4 3 0 一5 0 一7 0 乙醇逐级脱水，每次l O 分钟( 7 0 乙醇中含3 醋酸双氧铀) 4 “ C 块染；8 0 一9 5 一l o o 一1 0 0 乙醇逐级脱水，每次l O 分钟环氧丙烷洗涤二次，每次1 0 分钟6 1 8 包埋液与环氧丙烷1 ：1 ，浸透2 小时；6 1 8 包埋液与环氧丙烷2 ：1 ，浸透过夜；纯6 1 8 包埋液浸透6 小时包埋：6 0 “ C 烘箱内4 8 小时L K BV 型
