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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：避缢日期：2 地苎：苎：7中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离
2、校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以呆用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：姓垒 指导教师签名：垄迭厂蔓谣磊i 一、纳米粒子载体携带反义转化生长因子一B 1 基因的局部定位转染抑制大鼠自体移植静脉内膜增生的实验研究前言动脉粥样硬化闭塞症的发病率呈逐年升高的趋势，利用自体静脉行旁路转流手术是改善患者生活质量的一种重要手段，但术后由于血管平滑肌细胞( V S M C s ) 的迁移
3、、增殖以及细胞外基质( E C M ) 的过量堆积，导致移植静脉经常发生狭窄甚至闭塞，远期的通畅率小于5 0 。S c h w a r t z 等人研究发现，在人类的再狭窄血管组织中，V S M C s 仅占新生内膜体积的1 1 ，其余剩下的为E C M 。可见，E C M 在血管再狭窄的病理过程中起了很重要的作用。转化生长因子( T G F B 1 ) 作为一种具有广泛生物学效应的多效生长因子，是调节器官、组织E C M 代谢的关键因子，它通过与其I 型受体( T G F DRI ) 相结合进行信号传导。本实验通过建立大鼠的自体静脉移植模型研究T G F B 1 及其I 型受体基因的动态表达
4、，以及与血管组织E C M 的主要降解酶一基质金属蛋白酶一1 ( M M P 一1 ) 和它的抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂一1 ( T I M P 一1 ) 之间的关系，探讨它们与血管再狭窄之间的关系。针对移植静脉的狭窄以及闭塞，目前尚无有效的药物治疗方法，1 3 前兴起的基因治疗技术为其开辟了一条新的途径。基因治疗的关键环节是目的基因的选择和载体的选择。本实验应用硅纳米粒子包载的T G F S l 反义基因，对大鼠自体移植静脉进行局部定位转染，观察其对血管狭窄的作用，在分子水平上为防治移植静脉狭窄、闭塞提供新方法。实验材料1 主要试剂：p M A M n e o A n t iT G F p
5、l 、硅纳米粒子、T G F B l 、T G F J 3一RI 、M M P 一1 、T I M P 一1 单克隆抗体、S A B C 免疫组化试剂盒、R T P C R试剂盒等。2 主要仪器、设备：S X B 一1 型双人双目手术显微镜、显微手术器械、计 算机图像分析系统、P T C 一1 0 0 T M 型D N A 扩增仪、J S M T 3 0 0 型扫描电镜等。实验方法1 动物模型的建立：取体重2 5 0 3 0 0g 的雄性W i s t a r 大鼠，麻醉成功后，手术显微镜下，切取右侧颈静脉的内侧支，长约4 5 m m ，将之端端吻合到同侧的颈动脉。局部定位转染基因的方法：动脉
6、远心端与移植静脉吻合， 移植静脉的近心端插入导管并结扎，注入相同体积的纳米粒子一D N A 悬液或纳米粒子空载体悬液或生理盐水，保持一定压力3 0 分钟后，抽出液体，将其涂布到外膜，静脉近心端与颈动脉端端吻合，关闭切口。2 硅纳米粒子携带人反义T G F B 1 基因真核表达质粒的构建：环己烷、去离子水及正硅酸乙酯按一定比例混合，添加适量的氨水，室温反应2 4小时，丙酮洗脱，真空抽干。取纳米粒子0 0 9 9 ，用6 m l 去离子水重悬，超声分散2 小时，高温蒸汽灭菌。取5 0 m l 的纳米粒子悬液与4 m g 的反义T G F B l 质粒D N A 混合，加入1 m o l L 的N
7、a C l 溶液，室温下反应1 5 分钟，备用。3 指标检测：应用H E 染色和V e h o f f e 弹力纤维染色，辅以计算机图像分析系统，测量内膜及血管壁的厚度，评估移植静脉内膜增生程度。应用免疫组织化学检测T G F B 1 及其I 型受体的表达。应用W e s t e r n 印迹 检测T G F p l 、M M P l 及其抑制剂“ l I M P 一1 的蛋白表达情况。应用R T P C R 技术检测上述各指标m R N A 的表达情况。应用扫描电镜观测纳 米粒子的粒度及表面形态。2 结果1 移植术后第3 天，内膜无明显增厚；第7 天内膜增厚明显，可见大量从中膜迁移到内膜的V
8、 S M C s 和丰富的E C M ，与对照组相比，t = 1 0 2 1 8 ，P0 0 5 ) 。T G F B RI 阳性表达也为棕黄色颗粒状沉淀，在移植术后第3 天仅有少量表达，第7 天明显增高( t = 5 2 4 6 ，P 1 5 o 0 5 ) ，第1 4 天达到高峰，之后显著下降。值得一提的是，T G F 一1 3 r tI 阳性 表达的棕黄色颗粒除了分布在胞浆和胞膜，在细胞核也可见到少量表达 ( 见表2 及图2 ) 。表2 免疫组织化学检测T G F 一1 3 1 和T G F p RI 蛋白表达情况( 受4 - s ，)组别nT G F 一1 3 1T G F B RI对
9、照组61 2 1 03 天组7 天组1 4 天组2 8 天组61 4 5 士4 8 +63 5 9 9 3 62 1 0 7 5 。0 7 O 22 2 1 51 2 7 5 6 2 9 1 1 0 3464 4 2 93 0 1 1 P 0 0 5 ，与对照组相比图l A 移植术后第7 天内膜明显增厚，与对照组相比，P ( O 0 5 ，差异有统计学意义 ( H E 染色x l o o )1 6 图1 B 移植术后第1 4 天内膜增厚达到高峰，内膜增厚处可见弹力纤维断裂。与对照组相比，P 0 0 5 ，差异有统计学意义( V e r h o f f e 染色1 0 0 )图2 AT G F
10、p 1 蛋白表达于术后第7 天达到高峰，胞浆及细胞外基质染成棕黄色( 免疫组化染色x 4 0 0 )1 7 图2 BT G F B RI 蛋白表达于术后第1 4 天达到高峰。胞浆及部分胞核染成棕黄色( 免疫组化染色x 4 0 0 )讨论利用自体静脉行旁路转流手术是动脉硬化闭塞症的一种重要治疗手段，但术后移植静脉经常发生狭窄甚至闭塞，导致远期的通畅率小于5 0 。血管内膜增生，管腔狭窄是一个复杂的病理生理过程，E C M 过度沉积是这一过程的中心环节。T G F 一1 3 1 作为一种具有广泛生物学效应的多效生长因子，是E C M 产生和沉积的重要调控因子，通过两种机制刺激E C M 过度生成：
11、r G F B l 促进E C M 重要组成成分如胶原蛋白、纤维粘连蛋白等的合成H 1 。T G F B l 抑制E C M 降解酶如基质金属蛋白酶的合成，增加基质金属蛋白酶抑制剂的合成，进一步促进E C M 积聚“ J 。N a b e l 等人研究表明，应用T G F B l 表达质粒直接转染猪的正常的动脉壁，导致E C M 合成明显增加并伴有新生内膜增厚o 。本研究发现，血管移植术后第3 天T G F B l 的表达即有显著升高，第7 天后达到高峰，从移植术后第7 天开始正是血管内膜显著增生的时期。提示T G F B 1 可能与移植静脉内膜增生关系密切。T G F p l 表达增加，一方
12、面可能与移植术中内膜受到损伤，以及术1 8 后在动脉血流环境里持续机械张力的作用有关，另一方面，也可能与T G F B l 的自分泌和旁分泌有关。T G F B l 通过它的I 型和型受体，以及下游的S m a d 蛋白将信号从 细胞外传到细胞核。本研究发现，T G F B RI 的表达于术后第7 天明显升高，并于第1 4 天达到高峰，在时间上比T G F 一1 3 1 的表达晚，表明T G F B l的过度表达可能诱导了其I 型受体的表达。本研究还发现，T G F 一1 3 RI 不 仅在胞浆和胞膜表达，在细胞核也有少量表达( 如图2 B ) 。T G F B 1 作为E C M 的重要调控
13、者，在移植静脉再狭窄的过程中起了关键的作用，有可能成为阻止血管再狭窄病理过程的有效靶点。关于它在血管增生性疾病中的作用机理尚待迸一步研究。结论免疫组化结果显示，术后第3 天T G F B 1 阳性细胞明显增多，第7 天阳性表达达到高峰，术后第1 4 天有所降低，2 8 天回到基线水平。从移植术 后第7 天开始正是血管内膜增生的高峰期。提示T G F B 1 可能与移植静 脉内膜增生关系密切。T G F 一1 3 RI 在移植术后第3 天仅有少量表达，第7天表达明显增高，第1 4 天达到高峰，之后显著下降。T G F 一1 3 RI 的表达在 时间上比T G F B l 表达晚，表明T G F
14、一1 3 1 的过度表达可能诱导了其I 型 受体的表达。以上研究结果提示，T G F 一1 3 t 通过诱导其I 型受体的表达，调控E C M ，作用于移植静脉内膜增生的关键环节。T G F 一1 3 1 在移植静脉再狭窄的过 程中起了关键的作用。1 9 大鼠自体移植静脉中转化生长因子一B 1 和基质金属蛋白酶一1 及其抑制剂的基因表达刖茜众所周知，基质金属蛋白酶( M M P ) 在基质的沉积和降解过程中起关键作用，本实验针对血管组织细胞外基质的主要降解酶- - - M M P 一1 和它的抑制剂一金属蛋白酶组织抑制剂一1 ( T I M P 一1 ) 引，研究它们在W i s t a r
15、大鼠自体移植静脉模型中的表达，以及与T G F B l 之间的关系，以及三者与 血管再狭窄之间的关系。实验材料与方法一、实验材料1 主要试剂：兔抗大鼠T G F 一1 3 1 、M M P 一1 、T I M P l 单克隆抗体S a n t aC r u z生物素标记的羊抗兔I g G 二抗S a n t aC r u zT R I z o l 液。美国G i b c o 公司寡核苷酸引物上海生工 R T P C R 试剂盒大连宝生物1 0 的水合氯醛中国医大制药厂其它试剂国产分析纯2 主要仪器设备：S X B 一1 型双人双目手术显微镜显微手术器械计算机图像分析系统M e t aM o r
16、 p hB X 4 1 P T C 一1 0 0 T M 型D N A 扩增仪U V 一1 2 0 1 分光光度计2 0 上海光学仪器厂宁波手术器械厂0 L Y M P U S美国M J 公司 日本岛津S H I M A D Z U一一一一一一三一一验一一实一一一一一、-垂直电泳槽电泳凝胶成像分析系统J U N GR M 2 0 2 5 切片机C S 一型生物组织摊片烤片机二、实验方法1 动物模型建立及标本收集美国B i o R a d美国A l p h a 公司德国L e i c a湖北医用电子仪器厂2 4 只雄性W i s t a r 大鼠( 2 5 0 3 0 0 9 ，中国医科大学实验动物中心提供) ，建立颈部静脉移植模型，具体方法见实验一。术后随机分成3 、7 、1 4 、2 8 天组，每组6 只。在
