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1、摘要摘要生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基会引起生物大分子的损伤，从而引发 一些疾病。尽管人的机体有抗氧化防御系统，但是这些系统并不能完全有效地抵御或修复氧化作 用带来的损伤。外加一些抗氧化剂对协助体内氧代谢的平衡是很有帮助的，而具有抗氧化活性的 天然产物越来越受到人臂】的青睐。近年来，国内外对乳酸菌的生理活性有大量的研究报道但对 乳酸菌抗氧化活性的报道较少。 本研究以体外过氧化氢耐受能力为指标，从发酵食品中筛选m 2 株能够耐受高达l m 0 1 几过氧 化氢的乳酸菌。研究了两株乳酸菌完整细胞和无细胞提取物的D P P B 自由基和羟自由基清除能力 研究结果表明，菌体为浓度为1
2、 0 9 c f u m L 的L 1 0 0 1 完整细胞和无细胞提取物的D P P H 自由基清除率分 别为3 6 2 和3 7 9 ，同样浓度的F 1 2 完整细胞和无细胞提取物对D P P H 自由基的清除率分别为 2 4 4 和2 7 0 ；清除羟自由基实验表明，浓度为1 0 9 c f u m L 的细胞清除羟自由基能力与同体积的 I m m o l L 抗坏血酸相当，总抗氧化活性是以菌株抑制亚油酸过氧化能力判断的，两菌株与空白对 照相比都表现出一定抑制亚油酸过氧化的能力 对乳酸菌L 1 0 0 1 的生长特性的研究结果显示：菌株的最低生长温度为2 0 ，最高生长温度为 4 0 ，
3、菌株以3 5 - 3 7 的生长温度为佳，最高和最低初始生长p 拜为9 。0 和4 0 ，最适生长初始 p H 为6 O ；L 1 0 0 1 菌株的延迟期相对较短，4 h 左右开始进入对数生长期。1 2 h 就达到稳定期。采 用生理生化鉴定，形态特征、培养性状等鉴定手段对筛选所得的具有抗氧化活性的菌株L 1 0 0 1 进 行鉴定，最终确定为植物乳杆菌( L a c t o b a c i l l u sp l a n t a z t ) 。 进一步研究发现厶p l a n t a r u mL 1 0 0 1 的无细胞提取物S O D 活性为1 2 0 4 - 0 2 6 U 巾L ，G
4、S H - P x 活性为5 4 9 4 1 2 5 4 活力单位。且厶p l a n t a r u mL 1 0 0 1 中S O D 的活性并不受培养基中氧气浓度 的影响。通过菌体生长不同阶段S O D 活性的研究发现：厶p l a n t a z u m L l 0 0 1 的S O D 活性在1 2 小时 后( 对数生长期末) 已经达到最大值。培养基中锰离子、亚硒酸钠浓度对z p a n t a r v mL 1 0 0 1 的抗 氧化活性有一定的影响。 通过动物实验，研究抗氧化活性较高的厶p l a n t a r u m L l 0 0 1 对机体抗氧化指标的影响，包括 超氧化物
5、歧化酶( S O D ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( G S H P x ) 、过氧化氢酶( C A T ) 和血浆丙二醛( 如吣含 量。结果显示：灌胃抗坏血酸和厶p l a n t a r v L 1 0 0 1 的小鼠实验组相对于空白对照组其红细胞S O D 活力，全血G S H - P x 活力血浆C A T 活力有所升高，其中灌胃抗坏血酸和的高剂量组厶p a n t a r u m L 1 0 0 1 小鼠实验组相对于对照组，其血浆C A T 活性显著升高( P 为横坐 标，0 D 值为纵坐标，绘制厶M a n t a r L 1 0 0 1 的生长曲线。第三章抗氧化乳酸菌生长特性研究及菌
6、种鉴定765趔4 83210024 6 81 0 1 2 1 41 61 82 02 22 4时间( h )图3 - 5 厶p a n t a z 埘L 1 0 0 1 的生长曲线F i g3 - 5 t h eg r o w t hc l h - v eo fL p a n t a z 珊L 1 0 0 1从图3 - 5 可以看出，在豫S 培养基中，厶 a n t a z T mL 1 0 0 1 在4 h 左右进入对数生长期，1 2 h 左右进入稳定期。进入稳定期前，随着培养时间的增加，p H 不断下降。进入稳定期后，p H 也基本 保持不变培养2 4 h 后，p H 为3 9 6 。2
7、4 h 培养液中厶p l a z t a r u m L l 0 0 1 活菌数为2 3 X1o c f u m L 。3 3 5 4 菌株的运动性实验表明，厶p I a n t a x mL 1 0 0 1 在M R S 半固体培养基中生长良好，2 4 h 后可以看到菌株生长， 4 8 h 后有一条明显的生长线，边界清晰，周围没有菌体生长的现象，证明Lp a n t a r u mL 1 0 0 1 菌 株无运动性。3 3 5 5 菌株的抗生素敏感性一般而言，可抵抗抗生素的益生菌会对免疫缺陷宿主产生危害，一是可能分泌酶降解抗生素 嘲，另一可能是将抗抗生素基因转移给其它细菌。厶p a n t
8、a z L 1 0 0 1 是具有潜在应用价值的菌 株，必须考虑安全性。选择常用的2 4 种抗生素对其进行抗生素敏感试验。实验结果见表3 - 4 江南大学硕士学位论文如表3 - 4 ，是稳定期收获的厶p a n t a r u mL 1 0 0 1 菌液稀释1 0 0 倍，涂布在姗s 平板，3 7 厌 氧培养4 8 h 的培养结果。 由表可见，在本次试验的二十四种抗生素中，厶p l a a t a n 珊L 1 0 0 1 菌株对于红霉素、头孢三嗪、 氯霉素、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢呋新、头孢唑啉、利福平、氧哌嗪青霉素、复合磺胺、卡那 霉素1 1 种抗生素敏感，对庆大霉素、四环素、链霉素3 种
9、抗生素具有耐受性，呋喃妥因、氟哌酸、 氨苄青霉素、环丙氟哌酸、青霉素、丁胺卡那霉素、头孢他啶、苯唑青霉素、妥布霉素、万古霉 素1 0 种抗生素对厶p l a n t a r u m L l 0 0 1 的生长没有任何影响，其抗抗生素基因的稳定性有待进一步 研究。3 3 5 6 菌株的胆盐耐受性微生物对于胆盐的抗性是其能够在肠道存活、生长并发挥功效的先决条件之一胆盐对菌株 的抑制作用取决于胆盐的浓度和菌株本身的特性，不同消化道部位胆盐的含量不同，人体小肠中 胆盐含量在0 0 3 - 0 3 之间波动。能够在正常生理胆盐浓度中生长和代谢的菌株才可能在肠道 中存活。L p a n t a r u m
10、L 1 0 0 1 菌株在不同胆汁浓度的M R S 培养基中的生长情况见表3 - 5 。表3 - 5 不同胆盐浓度的培养基中L 可鲫a n L 1 0 0 1 的生长情况T a b 3 - 5 G r o w t ho f L p l a n t a r u mL 1 0 0 1i nM R Sb r o t hw i t hd i f f e r e n tb i l es a l tc o n c e n t r a t i o n s胆盐浓度( )生长情况0 OO 10 20 30 4O 51 O+ + + + +注：+ 十为培养基在2 4 h 之内变色，+ 为培养基在4 8 h 之内变
11、色，一为培养基不变色由表3 - 5 可见，L p a n t a r u mL 1 0 0 1 菌株的最高能够在胆汁盐浓度为0 2 的培养基中生长， 所以在作为益生菌应用时会受到一定的限制。2 4第三章抗氧化乳酸菌生长特性研究及菌种鉴定3 3 5 7 菌株的N a C l 耐受性菌株的N a C l 耐受性也是菌株的重要特性之一，其耐受值的高低也体现菌株所能够耐受的渗透 压以及在肠道中存活能力的高低，Lp l s n t a z u mL 1 0 0 1 的N a C l 耐受性如表3 _ 6 所示。表3 - 6L 川组加L 1 0 0 1 对于N a C l 的耐受性! 垫! 兰：型签! 坦
12、! 竺磐竺堕墨：2 塑i 塑芝生! 塑!N a C l ( )2 4 ( h )4 8 ( h )注：+ 为生长，一为不生长由表3 咱可见，厶p l a n t a r m a L l 0 0 1 在7 的N a C l 浓度下生长良好，在8 的N a C l 浓度下生长 缓慢，N a C l 浓度9 以上不生长，说明菌株能够耐受9 的N a C l 3 4 本章小结本章对乳酸菌L 1 0 0 1 的一系列生长特性进行了研究，得出以下结论： 1 L 1 0 0 1 菌株的最低生长温度为2 0 “ C ，最高生长温度为4 0 “ C ，菌株以3 5 - 3 7 的生长温度 为佳，最高和最低初始生
13、长p H 为9 0 和4 0 ，最适生长初始p H 为6 0 。 2 L 1 0 0 1 菌株的延迟期相对较短，4 h 左右就进入对数生长期，1 2 h 就达到稳定期。 3 采用生理生化鉴定，形态特征、培养性状等鉴定手段对筛选所得的具有抗氧化活性的菌株 L 1 0 0 1 进行鉴定，最终确定为植物乳杆菌( 1 d c t o b a c i l l u s p l a n t a r m nL 1 0 0 1 ) 。江南大学硕士学位论文第四章影响L p l a n t a r u mL 1 0 0 1 抗氧化活性的因素研究4 1 前言大多数微生物拥有酶促和非酶促两种抗氧化机制，可以降低活性氧对
14、细胞产生的危害抗氧 化酶类在防御活性氧损伤中起关键作用。已有研究表明乳杆菌具有抗氧化活性，可以降低食物消 化吸收过程中活性氧的不利影响。然而，乳酸菌缺失呼吸链中可以利用如作为最终电子受体的 底物”，所以乳酸茵中的抗氧化活性物质一直是乳酸菌抗氧化活性的研究难点乳酸菌细胞内外 的物质相当复杂，抗氧化作用涉及到多个方面，其抗氧化作用机制至今不很清楚。 乳酸菌体内有一些抗氧化酶类物质使得其具有抗氧化活性，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过 氧化物酶。S O D 酶能直接减少活性氧自由基的毒性，并阻止活性氧自由基向羟自由基的转变，大多 数乳酸菌是通过产S O D 酶和谷胱甘肽清除羟自由基和过氧化氢的”“。S
15、a n d e r s 等报道，乳酸乳 球菌有S O D 酶活性考虑到S O D 和G S H - - P x 在抗氧化中的重要作用，本章主要对L p l s n t m T L 1 0 0 1 的S O D 和G S H - P x 活性作初步研究。 s o D 是细胞内的主要抗氧化物质，是超氧自由基的专一清除剂。谷胱甘肽过氧化酶是消除过氧 化氢和羟自由基的酶。前面的实验发现厶p l a n t a r u m L l 0 0 1 对羟自由基有很高的清除率，并且有很 强的过氧化氢耐受力。所以本章中利用试剂盒检测了厶p a n t a z u mL 1 0 0 1 的S o D 和G S H
16、P x 活性，以 说明厶p l 鲫t a r u mL 1 0 0 1 对羟自由基的高清除率，以朗对乳酸菌抗氧化的机制进行初步的探讨。4 2 材料与方法4 2 1 试验菌株4 2 2 主要试剂S O D 测试盒 G S H - P X 试剂盒 亚硒酸钠4 2 3 主要仪器设备恒温气浴摇床 冷冻离心机 U V 2 1 0 0 紫外分光光度计 台式离心机 移液枪 高压蒸汽灭菌锅 p H 计4 2 4 试验方法4 2 4 1 无细胞提取物的制各同第二章2 3 2 2 的方法制备生化试剂生化试剂 分析纯南京建成生物工程公司南京建成生物工程公司 金山兴塔化工厂上海一恒科技有限公司 德国H E T T I c I 公司上海尤尼柯公司 上海安亭科学仪器厂E p p e r d
