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1、抗癌复方蛇葡萄素，5 一氟尿嘧啶脂质体的制箭和抗肿瘤作用的研究中山大学抗癌复方蛇葡萄素，5 一氟尿嘧啶脂质体的制备和抗肿瘤作用的研究研究背景和目的：专业：生药学硕士研究生：赵莉莎导师：刘德育教授中文摘要蛇葡萄素( A M P ) 是从粤蛇葡萄或显齿蛇葡萄中提取的小分子黄酮醇类化合物。近年来经过本课题组一系列抗肿瘤实验发现，蛇葡萄素在体外可显著抑制人早幼粒细胞白血病H L 一6 0 细胞、人红白血病K 5 6 2 细胞、人鼻咽癌H K 1 细胞、人肝癌B e l 7 4 0 2 细胞、人乳腺癌M C F 7 细胞的增殖【2 3 ，4 1 。蛇葡萄素具有毒性低，来源广泛，提取率高的优点。但其稳定性
2、较差，易发生氧化反应，给实际应用带来网难，将其制备成理想的剂型是解决这些问题的一个好办法。我们最近的研究发现，蛇葡萄素与阿霉素、5 一氟尿嘧啶、环磷酰胺等抗肿瘤药物联合应用可产生协同抗肿瘤作用。5 氟尿嘧啶( 5 F i u o r o u r a c i l ) 属于经典的抗代谢类癌症化疗药，广泛用于恶性肿瘤的治疗，目前仍然是治疗原发性肝癌的主要药物之一。但其存在着对肿瘤细胞的选择性差，毒、副作用大，半衰期短，久用易产生耐药性等缺点，限制了其临床的应用。单一采用一种药物化疗容易产生耐药性且治疗效果不好，目前多采用联合化疗，即两种抗癌药物甚至多种抗癌药物联合使用，可增加对癌细胞的细胞毒性；攻击
3、癌细胞的不同牛物化学靶点；具有不同的抗癌作用机理，产生加和( 或) 协同作用：克服癌细胞的耐药性；联合化疗对正常细胞不产生叠加毒性。抗癌复方蛇葡萄素，5 一氟尿嘧啶脂质体的制备和抗肿瘤作用的研究巾山大学将脂质体应用在肿瘤的治疗中是一个有意义的突破，脂质体可使药物具有靶向性和缓释性，脂质体包裹技术可以解决脂溶性药物不易溶于水的难题，提高易氧化药物在体内外的稳定性，降低被包封药物的毒性，增加药物被增殖旺盛的癌细胞的摄取量，是抗肿瘤药物的理想载体。本课题将蛇葡萄素和5 氟尿嘧啶两种抗肿瘤药物同时包封于脂质体给药系统制备成抗癌复方脂质体，解决了蛇葡萄素难溶性和不稳定性的问题；药物包封于脂质体后具有缓释
4、性，延长药物的释放时间；使两种药物同时进入癌细胞，产生协同作用提高对癌细胞的杀灭能力，达到提高药效，降低药物的毒副作用，减少药物对给药部位的刺激、损伤，提高病人顺应性的目的。方法：1 建立测定A M P 5 F U L P 中A M P 和5 - F U 含量的方法；建立分离游离药物和复方脂质体来测定A M P 5 F U L P 中A M P 和5 - F U 包封率的方法。2 比较几种脂质体的制各方法，以包封率为指标，确定最优制备方法；在单因素考察的基础上，采用正交设计进行优化处方和制备工艺，确定A M P 5 F U L P 的最佳处方组成和制备工艺条件。3 采用冷冻干燥技术将A M P
5、 5 F U L P 制备成复方脂质体冻干粉，考察了各种冻干保护剂的保护效果和影响冻干效果的各工艺过程，确定了最佳冻干工艺和冻干保护剂处方。4 对冻干前后A M P 5 F U L P 的理化性质进行了考察，包括粒径分布、包封率、Z e t a 电位、外观形态、p H 值等，用透射电镜观察脂质体的形态，并考察了复方脂质体的体外释药性，以各项理化性质为指标，考察了复方脂质体在6 个月内的初步稳定性。5 用M T T 法测定A M P 5 F U L P 对人白血病细胞K 5 6 2 增殖抑制的影响，计算抑制率和I C 5 0 ，同时，观察是否存在时间和剂量依赖性。6 用M T T 法测定A M
6、P 5 F u L P 对人肝癌细胞B e l 7 4 0 2 增殖抑制的影响，计算抑制率和I C s o ，同时，观察是否存在时间和剂量依赖性。U抗癌复方蛇葡萄素，5 一氟尿嘧啶脂质体的制备和抗肿瘤作用的研究巾山大学结果：1 建立了紫外分光光度法同时测定A M P 5 一F U L P 中A M P 和5 - F U 含量的方法，回归方程分别为A A M P = 0 0 4 3 2 6 c + 0 0 0 418 ，R 2 = 0 9 9 9 3 ；A 5 F U = 0 0 5 0 0 5 c +0 0 1 7 3 9 ，R 2 = 0 9 9 9 7 ；经精密度和回收率实验考查，各项指标
7、符合方法学测定要求；建立了葡聚糖凝胶柱层析法分离游离药物和复方脂质体来测定A M P 5 F U L P 的包封率的方法。2 确定薄膜分散超声法为制备方法，以单因素考察结合正交设计优选出的最佳处方和制备工艺为：主药：卵磷脂= I ：2 0 ，卵磷脂：胆固醇= 5 ：l ，磷脂浓度5 0 m g m L ：维生素E 的用量为5 ，磷酸盐缓冲溶液的p H 值为7 4 ，用量1 6 m L ，蛇葡萄素和5 氟尿嘧啶的用量各2 0 m g 。3 确定A M P 5 F U L P 冻干粉的最优冻干工艺为预冻温度7 0 ，预冻速度为快速降温，预冻时问为8 h ，冻干真空度 B C ，药脂比对其影响最大为
8、主要因素，其次是磷脂与胆固醇的比例为次要因素，而磷脂的浓度对其影响不大，最佳制备工艺抗癌复方蛇葡萄素，5 一氟尿嘧啶脂质体的制备和抗肿瘤作用的研究中山大学为A 3 8 3 C 3 。以复方脂质体中5 氟尿嘧啶的包封率为评价指标，各因素重要程度依次为A B C ，药脂比对其影响最大为主要因素，其次是磷脂与胆固醇的比例为次要因素，而磷脂的浓度对其影响不大，最佳制备工艺为A 3 8 2 C 3 。两个制备工艺方案相近，仅有因素B 不同。综合考虑，选择的最佳制备工艺为A 3 8 3 C 3 ，即药脂比为l ：2 0 ，磷脂与胆固醇的比为5 ：l 。2 2 6复方脂质体最优处方的验证按所得的最优处方，分
9、别制备三批复方脂质体，测定脂质体的包封率和粒径，结果见表2 5 。表2 5 优化处方制备复方脂质体的包封率和粒径优化处方和工艺制备的3 批复方脂质体包封率结果表明优化处方和工艺的重现性良好。2 2 7复方脂质体的制备工艺称取处方量的蛇葡萄素2 0 m g 、卵磷脂8 0 0 m g 、胆固醇1 6 0 m g 及Q 一生育酚4 0 r a g 溶于氯仿和乙醇( 1 ：1 ) 的混合溶液中，3 7 。C 左右减压真空旋转制膜，另称取5 氟尿嘧啶2 0 m g ，溶于1 6 m L 的p H 7 4 的P B S 溶液中作为水相，将水相溶液加入到圆底烧瓶中，将类脂膜洗脱并水合成脂质体初悬液，置探头
10、式细胞超声粉碎机超声5 分钟，功率为8 0 - 一1 0 0 W ，每超声1 0 s ，停1 0 s ，至形成半透明的乳白色脂质体溶液。抗癌复方蛇葡萄素，5 一氟尿嘧啶脂质体的制备和抗肿瘤作用的研究中I 大学2 3 讨论与小结2 3 1 讨论2 3 L 1目前脂质体的制备方法很多，如薄膜分散法、逆向蒸发法、超声法，熔融法、注入法、冷冻干燥法等，其中薄膜分散法是最简单的制备方法之一。实验中我们采用了三种制备方法分别制备脂质体，发现用薄膜分散法制备的脂质体包封率较高，脂质体最稳定，再结合超声法可以大大减小脂质体的粒径，方法简便、设备简单、重现性好。2 3 1 2 本文根据单因素考察的结果，发现影响
11、脂质体制备的主要因素有磷脂和胆固醇的比例，磷脂的浓度、药脂比、维生素E 的用量、水相介质的p H 值和超声时间。在此基础上采用正交设计法对复方脂质体的处方工艺进行优化，充分考察了三个主要因素不同水平对药物包封率的影响，从数据处理的结果来看，优化的制备条件重现性好，蛇葡萄素的包封率高达7 6 5 2 ，5 氟尿嘧啶的包封率高达4 6 3 l ，制备的脂质体稳定，重现性良好，优化成功。2 3 1 3 在脂质体制备过程中，需要加入一定量的胆固醇，胆固醇属于两亲性物质，其亲油性较亲水性强。磷脂与胆固醇相可= 间隔定向排列，形成双分子层，当温度在磷脂的相变温度以上时，可以增加磷脂的流动性，当温度在磷脂的
12、相变温度以F 时，胆固醇又可以增加双分子层的稳定性，使其更加牢固。因此，胆固醇与磷脂是共同构成脂质体的基础物质，亦称为“流动性缓冲剂“ 【加】。本文经过处方筛选，最佳处方中磷脂与胆固醇的比例为5 ：l 。2 3 2 小结本章在考察了薄膜分散超声法、逆相蒸发法、乙醇注入法的基础上，选用薄抗癌复方蛇葡萄素，5 一氟尿嘧啶脂质体的制备和抗肿j l i 作用的研究中山大学膜分散超声法制备蛇葡萄素，5 氟尿嘧啶复方脂质体，以复方脂质体中两种药物的包封率为主要考察指标，单因素考察有机相种类、药脂比、磷脂和胆固醇比、磷脂浓度、水浴温度等影响因素对复方脂质体处方的影响，并在此基础上，通过正交设计优化处方和制备
13、工艺，确定复方脂质体的最佳处方为：药脂比l ：2 0 ，磷脂与胆固醇的质量比5 ：1 ，磷脂浓度5 0 m g m L ，磷酸盐缓冲溶液的p H 值为7 4 ，蛇葡萄素和5 氟尿嘧啶的用量均为2 0 m g 。按照此处方制备的复方脂质体包封率大大提高，重现性良好，物理稳定性良好。抗癌复方蛇葡萄素，5 一氟尿嘧啶脂质体的制备和抗肿瘤作用的研究中山大学第3 章A M P 5 F U L P 冻干粉的制备工艺研究液态的脂质体是一种混悬液，在贮存过程中可能发牛化学和物理的变化，如磷脂会氧化和水解，生成短链的磷脂，并在膜中形成具有溶解性的衍生物；同时由于温度、光线等影响产生乳析、凝聚、融合、粒径变大等现
14、象。为了延长贮存期，使脂质体物理、化学稳定性增加，可用冷冻干燥方法，把脂质体悬浮液制成冻干前体脂质体【4 。冷冻干燥前体脂质体是前体脂质体的一种。系将己制成的空白或含药脂质体混悬液，在适当的条件下进行冷冻干燥，得到具有一定外形的粉状或饼状物，以固态形式存在。当加药物水溶液或水( 缓冲盐) 进行水化时即能转化为脂质体混悬液。冷冻干燥法是利用固体药物与适当的溶剂组成共熔体系的原理，根据相转移的理论，通过冷冻干燥使药物固体粒子微粉化。即在真空条件下，从冻结的水中，除去水分子，水分子不经液态直接从固态升华为气态，使药物得到干燥。冷冻干燥过程可以分为预冻、升华干燥，真空干燥三个过程。所得冻干产品正常的外
15、观是颜色均匀，孔隙致密，光滑饱满，保持冻干前的体积、形状基本不变，形成较硬的团块结构，加水后可以迅速完全溶解。如果出现有硬壳、萎缩、塌陷、空洞、灰散和破碎等现象，则为不合格产品。在微观上，不合适的冻干工艺或冻干处方会使脂质体在冷冻干燥过程中囊泡变大，甚至出现药物结晶，从而影响冻干脂质体的质量。因此，本章分别对冻干工艺各因素和冻干处方进行了考察。3 1 仪器与材料3 I I 仪器A L P H A l - 4 L S C 冷冻干燥机( 德国C H R I S T ) ；J B 2 恒温磁力搅拌器( 上海雷磁新径仪器厂) ；粒径及Z e t a 电位测定仪( N a n o Z S 9 0 马尔文
16、公司) ；A E 2 6 0 电子分析天平( M E T T L E R ) ；超声波细胞粉碎机( J Y 9 2 1 i D 型宁波新芝仪器研究所) ；微孔滤膜( 0 4 5 u m ，上海市新亚净化器什厂) ；紫外分光光度计( 7 5 2 紫外分光光抗癌复方蛇葡萄素，5 一氟尿嘧啶脂质体的制备和抚肿瘤作用的研究中山大学度计，上海精密科学仪器有限公司) ；无菌干燥西林瓶。3 1 2 材料葡萄糖( 上海化学试剂公司，分析纯) ；蔗糖( 上海化学试剂公司，分析纯) ；甘露醇( 上海化学试剂公司，分析纯) ；乳糖( 上海市定康药业有限公司) ；蛇葡萄素( 本研究室提供，纯度达9 5 以上) ；5 氟尿嘧啶( 上海邦成化工有限公司) ；卵磷脂( 注射剂，上海太伟药业有限公司，批号：0 7 0 2 0 8 ) ；胆固醇( 上海伯奥生物科技有限公司) ；维生素E ( 广
