《耐盐基因HVA1转化小麦及杨树的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《耐盐基因HVA1转化小麦及杨树的研究（37页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、峪S t u d i e s o n t h e T r a n s f o r m a t i o n o f W h e a t a n d P o p l a r C a l l u swi t h S a l t - t ol e r a n t G e n e H V A 1A b s t r a c tI t i s r e p o r t e d t h a t H v a l 伽h i c h i s e n c o d e d b y H V A I ) ，o n e o f t h e m e m b e r s o f L e a ( L a t e E m b r y
2、o g e n e s i s A b u n d a n t ) p r o t e i n f a m i l y , p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n p l a n t s u r v i v a l u n d e r s t r e s s s u c h a s s a l t a n d d r o u g h t . T o e x p l o r e H V A 1 s s a l t - t o l e r a n t f u n c t i o n , t w o t r a n s g e n i c m e t h
3、o d s w e r e e m p l o y e d i n t h e e x p e r i m e n t .O n e w a s i m p r o v e d p o l l e n t u b e m e t h o d : a f t e r t r a n s f e r r i n g p R Q 4 2 ( w h i c h c o n t a i n s P - u b i a n d H V A I ) i n t o t h e p o l l e n t u b e s o f w h e a t , i t s f l o w e r s w e r e
4、 d e f l a t e d . R e s u l t s o f P C R a n d d o t b l o t t i n g d e m o n s t r a t e d t h a t t h e t r a n s f o r m e d T l g e n e r a t i o n w i t h H V A I w a s s u c c e s s f u l l y o b t a i n e d . T h e t r a n s f o r m a t i o n r a t e i s 1 4 . 1 % , m u c h h i g h e r t h
5、 a n t h a t o f o t h e r D N A d i r e c tt r a n s f e r m e t h o d s .T h e o t h e r w a s a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d m e t h o d : H V A I h a d b e e n i n s e r t e d i n t o t h e b i n a r y v e c t o r p B i n A R ( w h i c h c o n t a i n s t h e C a M V 3 5 S p r o m o
6、 t e r a n d h p t I I g e n e ) ，t h e n t h e r e c o m b i n e d v e c t o r h a d b e e n t r a n s f e r r e d i n t o a g r o b a c t e r i u m E H A 1 0 5 w h i c h w a s u s e d t o i n f e c t p o p l a r c a l l u s . T h e t r a n s f o r m e d p o p l a r c a l l u s w a s i n c u b a t
7、e d o n d i f f e r e n t i a t e m e d i u m s . T h e P C R r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e E H A 1 0 5 h a d b e e n t r a n s f o r m e d . F u r t h e r w o r k i s n e e d e d t o c o n f i r m t h e s u c c e s s f u l t r a n s f o r m a t i o n o f p o p l a r c a l l u s .!K e y w
8、o r d s : S a l t - t o l e r a n c e , H V A I , b i n a r y v e c t o r , i n fl a t i n g p o l l e n t u b e m e t h o d , a g r o b a c t e r i u m , w h e a t , p o p l a r c a l l u s一一一一一一一一-前言土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问题。世界上存在着大面积盐渍 土地和次生盐渍化土壤， 全世界约有5 7 亿亩土地具有不同程度的盐渍化，约占可耕 地面积的1 0 9 6 。我国约有1 5 亿多
9、亩各种盐渍土地，主要分布在山东、河北、东 北、新疆、甘肃等沿海及干旱和半干早地区.土壤中含盐量高时， 植物吸收过量N a 十 、 C l - 等，使K + , C a l 等其它元素的吸 收受到抑制，导致作物缺乏某些元素而引起生长发育障碍;同时由于N a 十 的离子半 径与C a l 的离子半径非常相似，N a + 增加会把质膜、液泡膜、叶绿体膜等细胞膜上 的C a l 置换下来，使膜选择透性丧失，特别是C a t - 平衡被破坏，细胞质中游离C a t - 急剧增加，使C a l 二 介导的C a M 调节系统和磷酸醇调节系统失调，细胞代谢紊乱;并 且根细胞水势接近或高于土壤溶液水势时，根吸
10、水就会受到抑制，甚至发生水分倒 流导致细胞原生质体失水收缩死亡，对作物及林木伤害很大。随着我国人口 的增加及工业的高速发展，生态环境恶化，可耕地急剧下降，而 不合理灌溉、耕作等又造成了大量土壤的次生盐渍化。从而导致我国耕地绿地逐年 减少，严重威胁着我国的粮食生产和生态环境。因此，如何利用和开发我国上亿亩 盐渍化土壤，就成为我国农业生产及环境改造中十分迫切和重要的任务。过去几十年人们对如何开发利用盐碱地已做了大量工作， 但到目 前为止尚没有 取得突破性进展。原因主要是单纯依赖于工程措施改良 土壤，如淡水压盐、挖沟排 盐、引黄放淤、筑堤种植、暗管排盐等。这些工程措施投资大，又不能解决根本问 题，工
11、程一停， 土地马上泛盐，而且洗盐同时洗走土壤中的许多必需元素。采用生物学方法培育抗盐作物及林木是一种投入少，效果持久，土壤改良 彻底的有效途径。具体工作分为以下两种:传统育种1 杂交育种;2 大田 选育法:把植物种在盐渍土壤中，选择自 然的耐盐突变株，经若干代选 育后，可获得耐盐的作物品种。美国己 用这种方法选育出可用海水灌溉的大麦及番茄品种:3 组织培养法:将植物愈伤组织依次转接到递增N a C I 的培养基上，获得耐盐试管苗。利用这种方法已在烟草、水稻、玉米等作物获得耐盐植株;4 突变体选择法:利用化学诱变剂或射线等处理作物种子或幼苗，将其培育在 盐渍环境中，有可能获得抗盐突变体，利用这种
12、方法已获得大麦高脯氨酸突变体。基因工程随着对植物耐盐抗早生理机制的分子生物学研究的发展，人们逐渐确定了与耐 盐抗旱有关的重要基因，并进行了基因定位研究。由于传统育种存在着周期性长、 盲目 性大等缺点，近年来人们正在利用盐生植物抗盐基因导入作物细胞中获得新的抗盐作物，并取得一定进展。1 耐盐相关基因耐盐性( s a l t - t o l e r a n c e ) 是指植物无法阻止或排出盐分，而允许盐分进入植物体，但它们可以通过不同的生理途径忍受或部分忍受盐分的作用，而不致伤害。对 盐分胁迫下基因表达的变化的研究很多，也克隆到了一些与抗盐性有关的基因，归纳起来主要集中在以下几个方面:( 1 )
13、 可溶性溶质合成基因盐胁迫下植物细胞中脯氨酸，甜菜碱、多元酸等对代谢反应无毒害作用的溶质 主动积累，增大细胞浓度，降低渗透势， 使其能从外界吸收水份。甜菜碱在许多高等植物， 特别是琴科和禾本科植物，盐胁迫下都大量积累，而 且生物合成途径简单，进行遗传操作方便，因此甜菜碱合成酶基因便成为最重要和 最有希望的抗胁迫基因之一。催化生成甜菜碱的甜菜碱醛脱氢酶( b e t a i n e a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e , B A D H ) 己由几个实验室分别得到。 H a n s o n等( 1 9 9 0 ) 首 次成功地从菠菜c D N A
14、文库中克隆到B A D H 基因的c D N A .多元醇，如肌醇，甘露醇的 积累也与植物的抗盐性有关。催化 6 - 磷酸果糖变 成1 - 磷 酸 甘 露醇的1 - 磷酸 甘 露 醇 脱 氢酶( M a n n i t o l - l - P d e h y d r o g e n a s e , M t l D H ) 的 基因由T a k z y n s k i 等人( 1 9 9 3 ) 从大肠杆菌中克隆到。 并转化了 烟草悬浮细胞使烟草抗盐性提高。( 2 ) 协助水份渗透的膜蛋白 基因九十年代以来，人们发现了编码细胞膜上一大族蛋白质的基因，这类蛋白可以 协助水分子进入细胞，但同时离子和
15、代谢物分子不能通过.这种水通道蛋白 质分子 可在盐胁迫下协助水分运输，使细胞不致失水过多。 Y a m a g u c h i等( 1 9 9 2 ) 从拟南芥 菜( A r a b i d o p i s t h a l i a n a ) 中得到了 一些由 失水诱导表达的基因，测序后得到了 一 个编码跨膜水通道蛋白 的。 D N A 序列。( 3 ) 胚胎形成晚期富集蛋白的基因胚 胎形 成晚 期富 集蛋白 ( L a t e e m b r y o g e n e s i s a b u n d a n t p r o t e i n , L E A ) 最 初 是 从棉花种子发育晚期胚胎
16、中发现的一 类大量积累的蛋白 质( D u r e e t a l , 1 9 8 1 ) 。以 它们普遍存在的氨基酸序列域为基础， L E A 蛋白 被分为3 组，即G r o u p l L e a 蛋 白 、 G r o u p 2 L e a 蛋白、 G r o u p 3 L e a 蛋白。 G r o u p 3 L e a 蛋白 依其狡基末端氨基酸序 列的有无分为G r o u p 3 L e a ( 1 1 ) 和G r o u p 3 L e a ( I )。 3 组L e a 蛋白的同源序列 区域包括氨基酸基元序列的串联重复排列，基元序列形成亲水的a 螺旋结构，大多 数L e a 蛋白主要由碱性亲水氨基酸组成， 无半胧氨酸和色氨酸。其疏水面有利于形 成同二聚体，处在外表面带电的基团可中和因脱水而增加的离子。由L e a 蛋白的结构，目前推测L e a 蛋白可能有以下三方面的作用:i 作为脱水保护剂。由于L e a 蛋白 在结构上富含不带电荷的亲水氨基酸，一方 面，通过与细胞内的其它物质发生相互作用，使它们的结构保持稳定，如与可溶性 糖协
