《25kD蛋白在骨骼肌中定位和分子结构的论证以及与MG免疫发病关系的探讨》由会员分享，可在线阅读，更多相关《25kD蛋白在骨骼肌中定位和分子结构的论证以及与MG免疫发病关系的探讨（78页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、本研究使用的主要缩略词缩略语英文全名汉语译名M GA C h RA ( 孙R a bS N M GE A M GM G TM G HP r s M RT N F儿M u S KH L AO N M DR y RA L D I - T O F M SP M FH R PD A BE U S AC F AC A M y a s t h e n i ag r a v i sA c e t y l c h o l i n er e c e p t o rA c e t y l c h o l i n er e c e p t o ra n t i b o d yS e r o n e g a t i
2、v em y a s t h e n i ag r a v i sE x p e r i m e n t a la n i m a lM GM Gw i mt h y m o m aM Gw i t ht h y m i eh y p e r p l a s i ap r e - s y n a p t i cm e m b r a n er e c e p t o rT u m o rn e c r o s i sf a c t o rI n t e f l e u k i nM u s c l es p e c i f i ck i n a s eH u m a nl e u k o c
3、y t ea n t i g e n sO t h e rn e u r o m u s c u l a rd i s e a s eR y a n o d i n er e c e p t o rM a t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i s a t i o nt i m e - o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r yP c p t i d em a s sf i n g e r p r i n tH o r s e r a d i s hp e r o x
4、 i d a s eD i a m i n o b e n a i d i n eE n z y m e - l i n k e di m u n o s o r b e n ta s s a yC o m p l e t e 船u d Sa d j u v e n tC a r b o n i ca n h y d r a s e1 0重症肌无力乙酰胆碱受体乙酰胆碱受体抗体抗体阴性的重症肌无力实验动物M GM G 伴腌腺癯M G 伴胸腺增生突触前膜受体肿瘤坏死因子自细胞介素肌肉特异性激酶人类白细胞抗原其它神经肌肉疾病R y a n o d i n e 受体基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱肽质
5、量指纹图谱辣根过氧化物酶二氨基联苯胺酶联免疫吸附试验完全福氏佐剂碳酸酐酶I 复旦大学硕士研究生论文摘要 2 $ k D 蛋白在骨骼肌中定位和分子结构的论证 以及与M G 免疫发病关系的探讨普遍认为重症肌无力( M y a s t h e n i ag r a v i s ；M G ) 是乙酰胆碱受体( A C h R ) 抗体引起神经肌肉接头突触后膜A C h R 功能丧失的自身免疫性疾病，l 然而，单纯A C h R 机制不能解释许多临床和实验结果。例如，有1 5 的患者A C h R 抗体始终为阴性而临床表现却与M G 完全一致，此类患者称为A C h R 受体抗体阴性的重症肌无力( S
6、e r o n e g a t i v em y a s t h e n i ag r a v i s ，S N M G ) 3 , 4 1 。该类患者对血浆交换和免疫抑制裁治疗有反应，用这些患者的血清免疫动物可以获得E A M G 模型i s , e l ；近年来已发现一系列的非A c h 受体的骨骼肌骨架蛋白( t i t i n ) 、肌肉收缩蛋白( M y o s i n ，a c t i n 等) 、钙离子通道成分R y a n o d i n e 受体( R y R ) 、骨骼肌特异性激酶( M u s c u l a rs p e c i f i c 虹n 嚣e ；M U S K
7、 ) 抗体的滴度升高【7 1 1 1 7 从血细胞中筛选到一些与M G 相关的基因，一些与免疫相关的细胞因子( 肿瘤坏死因子，白介索或干扰素) 也参与者M G 的发病【12 ，1 3 】。因此，有些学者认为M G 存在多种发病机制，其发展也可能受多种因素的影响【1 4 1 。虽然目前国内外对M O 的研究主要集中在免疫机制方面，但是肌无力是众多肌肉疾病共同的临床表现，其中已经发现D I l c h e 加e 型肌营养不良和强直型肌营养不良患者都有骨骼肌肌球蛋白轻链组成的改交1 1 5 】。那么，作为各种抗体作用的靶器官和主要病变之所在，M G 患者骨骼肌本身的蛋白成分是否有变化? 能否从骨骼肌
8、本身来寻找治疗M O 的新途径昵? 近年，任惠民等【幡1 8 l 对不同来源的骨骼肌蛋白成分进行了分析，发现1 个相对分子量约2 5 k D 的蛋白质仞称P 2 5蛋白) 在M G 患者骨骼肌中的表达明显低于正常人和其他神经肌肉疾病( O t h e rn e u r o m u s e l ed i s o r d e r s ；o r , r m ) 患者，并且确认了该蛋白既与A C h R 分子无关，也不是肌球蛋白轻链成分，而是一种糖蛋白。都爱莲等【1 9 最近用免疫印迹方法分析了M G 、O N M D 和正常人骨骼肌以及人体不同组织的2 5 k D 蛋白表达，进一步证实了该蛋白在M
9、G 患者骨骼肌中呈特异性减少，而且该蛋白仅表达于骨骼肌；用免疫组化研究2 5 k D 蛋自在肌细胞的定位，发现该蛋白是存在于骨骼肌的胞浆内。然而，令人不解的是为何在同一块骨骼肌中有些肌纤维有2 5 k D 蛋白的免疫染色，有些肌纤维染色很浅甚至没有染色。由于组成骨骼肌的肌纤维分复旦大学硕士研究生论文为快纤维( 即H 型纤维) 和慢纤维( 即I 型纤维) ，因此，2 5 k D 蛋白在骨骼肌中的这种免疫染色特征是否与肌纤维的类型有关呢? 如果确与肌纤维的类型有关，那么，该蛋白在这类肌纤维中的表达减少与M G 临床表现又有什么关系呢?在最近的研究中，我们用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( M a
10、 t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o nt i m e - o ff l i g h tm a s ss p e c t r o M e t r y ；M A L D I T O F - M S ) 对2 5 k D 蛋白肽指纹图谱( p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n g ；P M F ) 进行了解析( 待发表) ，发现2 5 k D 蛋白与碳酸酐酶I I I ( C a r b o n i c a n h y d r a s e H I
11、 ；C A m )有较高的同源性，两者在组织含量、组织特异性分布、细胞定位、等电点各方面都基本一致。用正电子喷射测定2 5 k D 蛋白的精确分子量与。皿也几乎相同1 2 1 。尽管2 5 k D 蛋白的分子特性与C A I I I 是非常相似的，但我们认为，只有进一步论证两者具有相同的免疫反应特征以及它们的抗体之间能够竞争结合，才能真正确认M G 骨骼肌表达减少的2 5 k D 蛋白就是C A 。鉴于2 5 k D 蛋白仅在骨骼肌中有很强的表达，其他组织，包括心、肺、肾等几乎不表达【1 9 】，而且该蛋白用P B S 即可很容易地从骨骼肌中被提取，因此是否有可能M G 患者骨骼肌2 5 k
12、D 蛋白的减少与该蛋白从肌细胞中大量的泄漏有关呢? 另外，尽管M G 存在多种发病机制以及M G 的发展和治疗转归受多种因素的影响的观点已被越来越多的人接受f 1 4 】，但大量的研究仍集中在M G 的免疫研究方面，即便是一些在M G 的非A C h R 抗体免疫发病机制研究中所发现的物质，如M u S K 、R y R 和皿t i n 等，也是围绕着它们的抗体进行研究。那么，我们所发现的M G 骨骼肌减少的2 5 k D 蛋白会不会有可能是诱导M G 免疫发病的另一个抗原? 也就是说2 5 k D 蛋白是否参与了M G 的免疫发病呢?因此，在本课题中，我们首先需要进一步明确与论证2 5 k
13、D 蛋白在骨骼肌中的精确定位，这对了解该蛋白可能的生理功能是十分重要的。其次我们需要论证2 5 k D 蛋白是否就是C 枷分子，这可为进一步研究该蛋白与M G 发病的关系奠定坚实的基础。另外，由于M G 被认为是自身免疫性疾病，那么，骨骼肌特异减少的2 5 k D 蛋白( 即c A ) 与黼的免疫发病又有何关系? 阐明上述问题可为开拓新的临床治疗M G 的方法提供积极的、有价值的信息。2复旦大学硕士研究生论文第一部分2 5 k D 蛋白在骨骼肌中定位的论证用制备凝胶电泳从骨骼肌中提取和纯化的2 5 k D 蛋白，免疫雄性新西兰大白兔，制备该蛋白的抗血清。用E L I S A 方法检测抗体效价，
14、用免疫印迹方法验证抗体的特异性。结果显示，抗血清的效价至少为1 ：3 2 0 0 ，而且该抗血清具有很高的特异性，只与骨骼肌肌肉匀浆样品中的2 5 k D 蛋白谱带反应。为明确与重症肌无力相关的2 5 k D 蛋白在骨骼肌中精确定位，分别对正常人和M G 患者的骨骼肌相邻的连续冰冻切片进行A T P a s c 染色及2 5 k D 蛋白的免疫组化染色。结果表明，无论是正常人还是M G 患者的骨骼肌，2 S k D 蛋白均主要分布在I 型纤维；在相同免疫染色条件下，该蛋白在M G 骨骼肌的染色强度明显低于正常人。为进一步验证2 5 k D 蛋白主要分布在I 型纤维，用i m m u n o W
15、 e s t e r n b l o t 的方法检测以I 型纤维为主的比目鱼肌和以型纤维为主的肱三头肌中的2 5 k D 蛋白含量。结果显示，在相同的骨骼肌总蛋白量中，比目鱼肌的2 5 k D 蛋白表达水平明显高于肱三头肌。第二部分2 5 k D 蛋白与C A I I I 关系的论证为论证2 5 k D 蛋白是否为C A I I I ，用双向电泳结合i m m u n o - W c s t e m b l o t 分析与2 5 k D 蛋白抗体和C A I I I 抗体有免疫反应的骨骼肌蛋白生化特征。结果显示，与2 5 k D 蛋白抗体和C A I I I 抗体有特异反应的蛋白质具有相同的分
16、子质量和等电点。在此基础上，用D o tb l o t 与i m m u n o W e s t e r nb l o t 观察两种抗体对纯化的2 5 k D蛋白及骨骼肌蛋白匀浆的竞争结合。结果表明，两种抗体与2 5 k D 蛋白有明显的竞争结合，说明2 5 k D 蛋白确与C A I I I 为同一物质。用i m m u n o W e s t e r n b l o t 分析正常与M G 骨骼肌C A D I 的蛋白表达，结果表明，用2 5 k D 蛋白抗体与C A m 抗体检测获得的结果几乎是相同的。第三部分2 5 k D 蛋白与M G 免疫发病的关系为探讨2 5 k D 蛋白是否参与了M G 的免疫发病，用i m l T i u n o W e s t e r nb l o t 检测M G 患者、其他神经肌肉疾病( o N 曲) 患者和健康人的血清中的2 5 k D 蛋白水平的差3复旦大学硬士研究生论文异；用i n l l i l u n o W e s t e r nb l o t 与E L I S A 方法检测上述血清
