《外源性connexin43基因对大鼠骨骼肌卫星细胞表达connexin43蛋白的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《外源性connexin43基因对大鼠骨骼肌卫星细胞表达connexin43蛋白的影响（57页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中文摘要外源性c o n n e x i n 4 3 基因对大鼠骨骼肌卫星细胞表达 c o n n e x i n 4 3 蛋白的影响摘要目的由于缺血坏死而导致心肌细胞的减少是急性心肌梗塞及心脏衰竭的一个共同特征。对缺血性心肌损伤的治疗主要集中于改善心肌的血供，减轻心肌缺血的症状，却不能使心肌细胞再生，从而不能避免心衰的发生。因此，采用细胞移植代替不可逆性心肌细胞的丢失有望成为受损心肌修复的另一种有效途径。目前，用于心肌细胞替代治疗的移植细胞种类较多，包括骨骼肌卫星细胞，胚胎性干细胞和成体于细胞，胎儿心肌细胞等。骨骼肌卫星细胞所具有的易于获得、用自体骨骼肌卫星细胞移植无需免疫抑制、细胞在培养阶
2、段易于接受外源基因、不受伦理限制等优点而成为心梗区细胞移植研究的热点。移植细胞要发挥功能必须与周围正常心肌细胞在解剖结构上发生整合以达到同步收缩。缝隙连接( g a pi u n c t i o n ) ，又称间隙连接、通讯连接，是由相邻两个细胞之间的连接蛋白排列而成的一种特殊膜结构。相邻细胞通过缝隙连接所介导的细胞问通讯( g a pj u n c t i o ni n t e r c e l l u l a rc o m m u n i c a t i o n ，G J I C ) 进行着信息、能量和物质的交换，参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联，这对细胞的新陈代谢、内环境稳
3、定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。在心肌e P c o n n e x i n 4 3 为主要的连接蛋白，心肌细胞之间的电信号传导有赖于缝隙连接蛋白结构和功能的中文摘要完整，因此连接蛋白表达对于实现同时收缩意义重大。目前，有文献报道移植的原代骨骼肌卫星细胞因不能同宿主细胞形成良好的电偶联而导致实验动物心率失常。本研究通过将 携带有c o n n e x i n 4 3 c D N A 的真核表达载体，以l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 为转染试剂转染大鼠骨骼肌卫星细胞，并通过免疫细胞化学技术、激光共聚焦扫描技术、w e s t e r n - b l
4、 o t技术等观察缝隙连接蛋白c o n n e x i n 4 3 在大鼠骨骼肌卫星细胞中的表达的情况，并从中选取c o n n e x i n 4 3 蛋白表达高的细胞。该细胞可用于进行移植细胞之间及移植细胞与宿主细胞之间能否形成良好的电偶联的研究。方法1 将携带c o n n e x i n 4 3 c D N A 的真核表达载体B i l l n e o 导入D H 5C l 大肠杆菌中扩增，再提取、纯化及鉴定质粒。将携带c o n n e x i n 4 3 c D N A 的真核表达载体B i l l n e o 导入大肠杆菌D H 5Q 菌株，用含氨苄青霉素的L B 平板选择阳性
5、菌落。按天根小提质粒试剂盒和W i z a r d P u r e f e c t i o nP l a s m i dD N AP u r i f i c a t i o nS y s t e m 操作说明进行质粒的提取纯化，最后进行酶切鉴定。2 大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞培养复苏大鼠M 骨骼肌卫星细胞后，在3 7 “ C ，5 C 0 2 条件下，用D M E M 完全培养基( 含1 5 胎牛血清，青霉素l O O U m l ，链霉素1 0 0 U m 1 ) 培养，每4 8 d , 1 j 寸“ 换液。为保持其理想未分化状态，当细胞达至U 6 0 一7 0 融合时，即进行传代。3 转染
6、e o n n e x i n 4 3 基因的大鼠M 骨骼肌卫星细胞的G 4 1 8 筛选浓度的确定将大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞以5 1 0 5 的密度种植与6 孔培中文摘要养板中，于完全培养基中分别加G 4 1 8 使其终浓度分别为l O O m g m l ，2 0 0 m g m l ，2 5 0 m g m l ，4 0 0 m g r n l ，6 0 0 m g m l ，各浓度3复孔，正常对照3 复孔( 即不加筛选抗生素) 培养1 4 天后观察细胞死亡情况，选择高于杀死全部细胞药物浓度一个梯度的浓度为筛选浓度。4 脂质体体外转染骨骼肌卫星细胞，确定最适转染条件及阳性单克隆细胞的获
7、得大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞以5 1 0 5 ，密度接种在3 5 r a m 培养皿中培养，2 4 小时后达7 0 融合。将l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 同E G F P N 】按不同比例混合，其余操作按l i p o f e e t a m i n e 2 0 0 0 转染试剂说明进行基因转染，确定最适转染比例。再将脂质体与携带c o n n e x i n 4 3 c D N A 的真核表达载体B i l l n e o 按最适比例混合，进行转染。转染2 4 d , 时后加入G 4 1 8 ( 4 0 0 m g r a l ) 筛选。1 4 天后挑取
8、具有G 4 1 8 抗性的阳性单克隆细胞分别扩大培养( 以下称阳性单克隆细胞) 。5 免疫细胞化学法和W e s t e r n b l o t 法检测阳性单克隆细胞中c o n n e x i n 4 3 蛋白表达的结果5 1 免疫细胞化学法检测阳性单克隆细胞中e o n n e x i n 4 3 蛋白表达取转染c o n n e x i n 4 3 基因和转染空载体贴壁生长的细胞分别爬片，用4 的多聚甲醛固定，行免疫细胞化学染色，检测细胞中e o n n e x i n 4 3 蛋白的表达情况，并由图象分析软件分别计算出随机视野中阳性细胞的光密度值；统计方法选用单因素方差分析法。5 2w
9、 e s t e r n b l o t 法检测阳性单克隆细胞中c o n n e x i n 4 3 蛋白表达中丈摘要提取细胞总蛋白，用考马斯亮蓝进行蛋白定量，制备不连续S D S 聚丙烯酰胺凝胶( 4 浓缩胶和1 0 分离胶) 。取各组变性胞浆蛋白上样于凝胶加样孔内，进行恒压电泳。用水浴式电转移装置将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜( N C膜) 上，将膜置于5 脱脂奶粉封闭，加兔抗大鼠c o n n e x i n 4 3蛋白多克隆抗体，4 “ C 孵育过夜。加入H R P 标记的羊抗兔I g G二抗，3 7 孵育1 h 。采用化学发光法观察结果。用S c i o n I m a g e
10、软件对结果进行半定量分析，统计方法选用单因素方差分析法。结果1 携带c o n n e x i n 4 3 c D N A 真核表达载体B i l l n g o 的酶切结果及质粒纯度、浓度结果酶切电泳结果显示前方的细条带大小约1 7 k b ，与e o n n e x i n 4 3 基因的c D N A 大小相符，后方的较粗条带大小约6 9 k b ，与载体大小相符。扩增质粒的浓度：O D 2 6 0X5 0X5 0 = 1 5 0 m g m l - - 4 0 0 m g m l扩增质粒的纯度：O D 2 6 0 O D 2 8 0 = 1 8 2 1 8 6结果显示质粒浓度较高，纯度
11、较好，可用与细胞体外转染2 大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞培养贴壁生长的大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞呈梭形，当细胞相互接触后会发生细胞融合，形成肌管。3 转染c o n n e x i n 4 3 基因的大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞的G 4 1 8 筛选浓度G 4 1 8 的筛选浓度为4 0 0 m g m l 。4 携带c o n n e x i n 4 3 c D N A 的真核表达载体B i l l 1 l e O 转染大鼠L 6中文摘要骨骼肌卫星细胞的最适转染条件及阳性单克隆细胞的获得4 1 携带c o n n e x i n 4 3 c D N A 的真核表达载体B i l l n e o
12、转染大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞的最适转染条件结果显示脂质体与质粒比例为1 ：1 时发荧光的细胞最多，表明质粒被转染进入大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞并获得表达。故本实验脂质体与质粒最适比例确定为1 ：1 。最高转染效率可达4 0 。4 2 大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞转染c o n n c x i n 4 3 c D N A 后阳性单克隆细胞的获得转染后的大鼠L 6 骨骼肌卫星细胞呈圆形，加入G 4 1 84 0 0 m g m l 进行筛选，细胞死亡明显，1 4 天后筛选出少量阳性单克隆细胞。对照组细胞经G 4 1 8 在相同浓度下筛选1 4天后全部死亡。5 免疫细胞化学和W e s t e r
13、n b l o t 法检测阳性单克隆细胞中e o n n e x i n 4 3 蛋白表达的结果5 1 免疫细胞化学法检测阳性单克隆细胞c o n n e x i n 4 3 蛋白表达的结果阳性克隆组：细胞呈梭形，略圆钝。胞浆中出现了棕黄色的颗粒状物质，分布不均；染空载体组：细胞呈梭形。胞浆中未见明显的棕黄色的颗粒状物质。通过图像分析软件检测组间阳性细胞的平均光密度，发现阳性克隆组e o r m e x i n 4 3 蛋白表达明显高于转染空载体组。5 2w e s t e r n b l o t 法检测阳性单克隆细胞c o n n e x i n 4 3 蛋白表达的结果将显色条带扫描至计算机
14、中，用S d o n I m a g e 软件对结中文摘要果进行半定量分析，用任意单位A U ( D 一_ 九a s i a ) 表示凝 胶谱带的面积荧光强度值，发现发现阳性单克隆组c o n n e x i n 4 3 蛋白表达明显高于空载体组，两组有显著差异。伟 染空载体组为O 8 9 0 1 0 1 阳性单克隆1 组为2 1 3 8 - 4 -0 0 9 8 阳性单克隆2 组为2 2 3 6 _ _ _ 0 1 6 8 ，P ( g 离，1 l , 2 0 分钟，同时将一含有吸附质粒滤膜的离心柱置子2 m l 收集管上待用；4 1 4 6 将上述的上清液移入含有吸附质粒滤膜的离心柱中；4
15、 1 4 71 3 0 0 0 X g 离心1 分钟，弃滤出液；4 1 4 8 加入0 5m l 磷酸缓冲液，1 3 0 0 0 Xg 离心1 分钟，弃滤出液：4 1 4 9 再离。C , q 分钟以除去残余洗液；4 1 4 1 0 将含有吸附质粒滤膜的离心柱置于另一洁净无菌的1 5 m l E P 管中，j 1 5 0I tl 洗脱缓冲液( E B 缓冲液) 于含有吸附质粒滤膜的离心柱中心，静置1 分钟，1 3 0 0 0 g 离心1 分钟，研究论文洗脱下来的液体即为纯化的质粒D N A 。提取的D N A 置2 0 。C保存备用。4 1 5 酶切鉴定所提取质粒：根据质粒的酶切说明，采用E
16、e o R I 单酶切鉴定。酶切的反应体系为：去离子双蒸水1 0 口1H B u f f e r2 U lE e o R I4 U l质粒D N A4 u l ( 0 6 V g )3 7 水浴2 d , 时，1 琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，凝胶摄像系统成像。4 1 6 检测真核表达载体B i l l n e o 含量及纯度：( 紫外分光光度法)取2 plD N A 样本，加双蒸水1 1 8 ul ( 稀释6 0 倍) ，混匀，转入分光光度计的石英比色杯中，分别测其在波长为2 6 0 n m和2 8 0 h m 时的吸光值。D N A 样品的质量用O D 2 6 0 O D 2 8 0 评定，D N A 样品的浓度用O D 2 6 0 计算。 D N A 样品的浓度= O D 2 6 0 X5 0 X 稀释倍数 D N A 样品的纯度= O D 2 6 0 O D 2 8 04 1 7 中等量
