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1、 目录I I I I II II I II I I I III t lIIIl Y 19 012 71中文摘要OO OOOO QOOOOOOIO 1英文摘要OO 000 3研究论文青蒿琥酯对K 5 6 2 细胞中S F R P s 家族表达的影响前言一6月I j 舌”一一”“”“”“材料与方法OGOOOO 7结果一o Ioooooooo o o ooo 一1 7附图OOOOOO 1 9附表2 2讨论2 4结论- 0Oooo0 3 0参考文献0OOOO0 OOO O OO 3 0综述S F R P s 家族甲基化在肿瘤发生中的作用3 4致i 身 4 9个人简历ma0ooo oooooo 00oB
2、oo 5 0中文摘要青蒿琥酯对K 5 6 2 细胞中S F R P s 家族表达的影响摘要目的：研究证明W n t 信号通路的异常活化与肿瘤的发生发展密切相关。细胞表面卷曲蛋白( F r i z z l e d ，F z d ) 是W n t 通路的特异性受体，通过p 连环蛋( a ( 1 3 c a t e n i n ) 激活其下游的一系列信号来刺激肿瘤细胞的生长。分泌型卷曲相关蛋( j ( s e c r e t e df r i z z l e d r e l a t e dp r o t e i n s ，S F R P s ) 是W n t 通路的主要拮抗因子，通过与F z d 受
3、体竞争结合W n t 蛋白而抑S g w m 通路的进行。最近研究发现S F R P s 家族在多种肿瘤细胞中呈现低表达，与肿瘤细胞中s f印s 基因启动子发生甲基化密切相关。D N A 甲基化转移酶( D N Am e t h y l t r an s f e r a s e s ，D N M T s ) 是参与D N A 甲基化过程的关键酶，D N M T s 基因高表达可能促使某些抑癌基因启动子区发生甲基化使其转录失活，促进肿瘤的发生。青蒿琥酯( A r t e s u n a t e ，A R T ) 是青蒿素的衍生物，是治疗疟疾的特效药，近年的研究表明青蒿琥酯还具有抗多种肿瘤细胞的作
4、用。本实验通过用青蒿琥酯处理K 5 6 2 细胞，研究S F R P s 家族、D N M T s 家族基因的表达水平及经典W n t 通路中p - c a t e n i n 蛋白的表达水平，进一步研究青蒿琥酯抑$ I J K 5 6 2细胞增殖的机制。方法：利用M T T 法检测不同浓度的青蒿琥酯对K 5 6 2 细胞的增殖抑制作用；利用A n n e x i n V P I 双染及流式细胞术检测青蒿琥酯处理K 5 6 2 细胞4 8 h的凋亡率及细胞周期的变化；用R T - P C R 法检测不同浓度的青蒿琥酯( 0 、4 、1 0 、2 0 、4 0 9 9 m 1 ) 处L 里K 5
5、 6 2 细胞4 8 h 对s f r p l 、s f r p 2 、s f r p 4 矛l d n m t l 、d n m t 3 a 、d n m t 3 b 的m R N A 市N 对表达水平，用W e s t e r nb l o t t i n g 法检测p c a t e n i n 蛋白的表达水平。结果：1 青蒿琥酯可显著抑$ 1 J K 5 6 2 细胞增殖，诱导细胞发生凋亡。A R T 作用4 8 时，终浓度4 9 9 m l 的A R T 对K 5 6 2 细胞的生长抑制率达5 4 2 9 ，1 0 9 9 m l的A R T 对K 5 6 2 细胞的生长抑制率达5
6、8 0 3 ，与4 9 9 m l 组比较抑制率增加( P O 0 5 ) ，随着A R T 浓度增加，s f r p 2 的m R N A 相对表达水平亦逐渐增加( P O 0 5 ；c o m p a r e di n t e r m e d i a t ea n dl a t ea p o p t o s i sb e t w e e n10 卜t g m la n d2 0 p t g m lg r o u p s 桴P 0 0 5 2 2研究论文T a b l e3E f f e c to fA R To nt h ec e l lc y c l ed i s t r i b u t
7、 i o no fK 5 6 2c e l l sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sf o r4 8h o u r s ( X 士S ，n = 3 ) N o t e ：C o m p a r e dt h eSc y c l ep h a s eb e t w e e n2 0 t g m la n d4 0 1 a g m lg r o u p s宰P 0 0 5 ；c o m p a r e da m o n gt h er e s tc y c l ep h a s e so fK 5 6 2c e l l st r e a
8、t e dw i t hA R Ta td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sf o r4 8h o u r sP 0 0 5 ，c o m p a r i s o no f t h er e s tg r o u p sP 5 0 ，长度 2 0 0 b p 的D N A 序列，主要位于管家基因和一些组织特异性基因的5 端，约6 0 的人类基因组启动子区含有C p G 岛 1 6 】。通过D N A 甲基敏感限制性内切酶分析，发现人类基因组的甲基化与非甲基化区域间隔排列，非甲基化区主要存在于启动子区C p G 岛、基因的5 端和第一个外显子斟
9、r 7 1 。目前研究发现，D N A 甲基化可以发生在基因编码区和启动子区，但基因编码区的甲基化并不影响基因的表达，而启动子区C p G 岛甲基化引起基因表达沉默或下调【l 引。一般认为启动子区D N A 甲基化主要通过两种途径抑制基因表达：第一种是甲基化C p G 岛的甲基基团可以阻止特异性转录因子与启动子C p G位点的结合，直接抑制基因转录【l 卅；另一种是通过D N A 甲基结合蛋白综述( M e t h y l C p G b i n d i n gp r o t e i n s ，M a D ) 招募一些阻碍复合物与启动子区甲基化D N A 特异性结合，抑制了转录因子与特定D N
10、 A 序列的结合间接抑制基因转录【2 0 1 。组织特异性基因启动子区C p G 岛保持非甲基化或低甲基化状态，使特定组织中该类基因表达增加，使细胞向特定的方向分化；而组织中的非活性基因则呈高甲基化状态，表达受抑制，许多非活性基因不能表达主要是由于启动子区域的C p G 岛高度甲基化而不能启动转录，导致基因沉默【2 。一般情况下，启动子区的C p G 岛处于非甲基化状态，基因能正常表达；当其发生甲基化后，便影响基因的转录调控，使基因表达沉默或下调。因此，D N A 甲基化与基因转录活性密切相关，一些抑癌基因由于启动子的甲基化使该基因表达沉默或下调在组织细胞的生长分化和肿瘤的发生发展中起着重要作
11、用【2 2 1 。2 2D N M T s 家族介绍目前在哺乳动物中发现了3 类D N M T s ，D n m t l ，D n m t 2 和I D n m t 3 ，D n m t 3包括D n m t 3 a 、D n m t 3 b 并f l D n m t 3 L ，D n m t 3 L 缺乏有效的催化结构而无催化活性，但能够增强D n m t 3 a 、D n m t 3 b 的活性【2 3 1 。D n m t 2 的结构和功能尚未完全明确，目前研究认为它的D N A 甲基化酶活性可能非常弱，而且识别位点并非C p G 位点，在体外实验中，很难观测至I J D N A 甲基化
12、酶活性【2 4 1 。D n m t le l i D n m t 3 a 、D n m t 3 b 在D N A 甲基化修饰过程中起主要作用。人类D N A 甲基化的完成主要通过D n m t l 和D n m t 3 a 、3 b 的作用。D n m t l 定位与染色体1 9 p 1 3 2 ，主要功能是在每次D N A 复制后，对新合成的D N A 链进行甲基化修饰，并参与维持D N A 的甲基化状态，也是非C p G 位点从头甲基化所必需的甲基化转移酶【2 5 1 。D n m t 3 a 定位于人染色体2 p 3 3 ，D n m t 3 b 定位于人染色体2 0 q 1 1 2
13、，两者的功能主要是催化非甲基化的D N A 成为甲基化的D N A ，并可以建立起胚胎时期的甲基化模式，主要参与D N A 的从头甲基化【2 6 1 。D N A 甲基化转移酶抑制剂5 杂氮2 脱氧胞嘧啶( 5 a z a 2 - d e o x y a z a cy t i d i n e ，D A C ) 是胞嘧啶类似物，它可替代胞嘧啶与D N M T s 结合至I J D N A 上，抑制D N M T s 对启动子区C p G 位点的甲基化，从而随着细胞分裂的进行，D N A 甲基化程度进行性减低【2 7 】，使一些抑癌基因表达增多。2 3D N M T s 与H D A C s 的相
14、互联系研究者发现了5 种D N A 甲基化结合蛋白，M B D l 、M B D 2 、M B D 3 、 M B D 4 和M e C P 2 。M B D l 、M B D 2 、D 4 能够与m C p G 结合，M B D 3 没有综述特异性结合甲基化D N A 的能力【2 引。其中，M e C P 2 是唯一能识别单个甲基化C p G 位点的结合蛋白，M e C P 2 能够通过转录抑制区( T R D ) 与甲基化的D N A 形成复合物。N a n 掣2 9 】发现，M e C P 2 通过T R D 与甲基化的C p G 结合，再与转录抑制子S i n 3 A 等结合，进一步与
15、异二聚体M a d M a x 结合，并募集组蛋白去乙酰化酶( H D A C s ) 形成转录抑制复合体。这一发现把D N A 甲基化和组蛋白去乙酰化联系起来，证明了D N A 甲基化结合蛋白与组蛋白去乙酰化酶在细胞内共存于一个复合物中，认为D N A 甲基化与组蛋白去乙酰化共同作用调控基因转录过程。当组蛋白在H D A C s 的作用下发生去乙酰化时，由于核心组蛋白富含带正电荷的碱性氨基酸与D N A 具有高度亲和性，因此D N A 与核心组蛋白结合紧密，从而阻碍了基本转录因子进入启动子结合位点，导致转录功能受到抑制【3 0 1 。F u k s 等【3 l 】通过实验证明了D N M T l 能直接与H
