大蒜素对神经母细胞瘤生长的抑制作用

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1、第 3 0卷第 3期 2 0 0 9年5月 中山大学学报 ( 医学科 学版) J O U R N A L O F S U N Y A T S E N U N I V E R S I T Y( M E D I C A L S C I E N C E S ) Vo 1 3 O No 3 Ma v 2 0 09 大蒜素对神经母细胞瘤生长的抑制作用 曾纪 晓 ，孙俊杰 ，莫家骢 ，马毅 ，何 晓顺 ( 1 广州市儿童医院普通外科，广东 广州 5 1 0 1 2 0 ；2 中山大学附属第一医院4 , J L b 科 ，广东 广州 5 1 0 0 8 0 ； 3 中山大学附属第一医院器官移植科 ，广东 广

2、州 5 1 0 0 8 0 ) 摘要：【 目的】探讨大蒜素对神经母细胞瘤生长的影响及相关机制。 【 方法】M T F 法测定不同浓度大蒜素对神经母细 胞瘤细胞生长的影响； 建立裸鼠人神经母细胞瘤皮下移植瘤模型 2 4只( r t =8 ) ， 随机分为对照组、 大蒜素 I 组 ( 1 mg k g d ) 和大蒜素 组( 1 0 m g k g d 一 ) ， 观察其对肿瘤生长的影响， 荧光定量 P C R法测定大蒜素对裸鼠皮下移植瘤 V E G F m R N A表 达的影响； E L I S A法测定裸鼠血浆 V E G F 浓度 ； 免疫组化法观察肿瘤微血管密度。【 结果】不同浓度的大蒜

3、素均能抑制神经 母细胞瘤细胞的生长， 高浓度的大蒜素能直接杀死肿瘤细胞 ； 大剂量和小剂量大蒜素对裸鼠神经母细胞瘤皮下移植瘤均有 抑制作用。对照组、 大蒜素 I 组和 组的肿瘤体积为( 2 1 4 31 2 7 )m m 、 ( 1 0 4 18 9 )mm 和( 9 0 46 5 )m m ( P8个红细胞面积 的血管排除在 外 。微血管密度( MV D ) 为平均微血管数 目 0 2 1 6 。 本过程按盲法操作。 1 7 统计学方法 数据用均数4 - 标准差( 4 - s ) 表示 ， 采用 t 检验 和方差分析 。 采用 S P S S 1 1 0软件包 ， 取 0 c =0 0 5

4、。 第 3 期 曾纪晓， 等 大蒜素对神经母细胞瘤生长的抑制作用 2 6 1 2 结 果 2 1 倒置相差显微镜下 S K N S H细胞形态观察 正 常生长 的 S K N S H 细胞呈梭形或多角形 。 有较长的突起 ， 呈单层贴壁 ， 生长迅速 ， 代谢 旺盛 ， 4 8 h须换 液一次 ， 34 d传代 1次。对照组细胞 大小 、 形态不规则 ， 但差异不大 ， 折光性好 ， 边缘清 晰， 内含丰富颗粒。药物处理组 1 2 h后细胞大小 、 形态和贴壁能力较对照组有明显差别 ：低浓度大 蒜素组 ( 1 0 、 2 0 g L ) 作用后 ， 细胞形态变化不大 ， 贴壁 尚可 ； 较高浓

5、度大蒜 素组 ( 4 o g L ) 作用后 ， 细胞明显皱缩 ， 突起少见 ， 细胞 间隙增大 ， 细胞 内 颗粒颜色加深 ，折光性增强 ，大量细胞呈片状脱 落 ，培养液 中有多量细胞漂浮 细胞生长明显减 缓。处理 2 4 h后上述变化更加明显。高浓度大蒜 素组 ( 4 0 0 、 4 0 0 0 g 几 ) 作用 1 2 h后 ， 绝大部分肿 瘤细胞死亡 ( 图 l A、 B ) 。 2 2 大蒜素对人神经母细胞瘤 S K N S H 细胞生 长的影响 M TI 法结果显示不 同浓度 的大蒜素对人神经 母细胞均有抑制作用 ， 与对照组 比较 ， 差异有统计 学意义 ( P0 0 5 ) ；

6、 高浓度 的大蒜素可直接杀死神 经母细胞 ( 表 1 ) 。 2 3 裸鼠皮下移植瘤成瘤率及大蒜素的影响 2 4只裸 鼠全部成瘤 ， 成瘤率 1 0 0 。S K N S H 细胞接种后 1 周左右成瘤。各组裸 鼠实验期间 ， 精 神 、 反应和饮食正常 ， 实验结束时 ， 2 4只裸 鼠均存 活 。 无裸 鼠死亡退 出实验 ， 对照组裸 鼠肿瘤表面有 明显出血和坏死 ， 血管丰富。与对照组 比较 ， 不 同 剂量 的大蒜素 能明显 抑制皮下移植瘤 的生长 ， 肿 瘤的重量和体积差异有统计学意义 ( P0 0 5 ) ； 小 剂量组与大剂量组 间比较 ，差异有统计学意义( P 0 0 5 ：

7、表 2 ， 图 2 ) 。 表 1 不 同浓度大蒜素作用 S K N S H细胞不 同时间后的 A值 Ta b l e 1 Ab s o r b a n e e o f c e H l i n e s S K-N- -S H t r e a t e d b y Al l i e i n o f va r i o us c o nc e nt r a t i on s i n di f f e r e nt t i me s ( s ， n = 6 ) AN O V A a mo n g a l l g r o u p s ，P0 0 5 ；1 ) C o mp a r e d w i t h

8、c o n t r o l g r o u p，P001 2 4 大 蒜 素 对 裸 鼠 人 神 经 母 细 胞 瘤 V E GF mR NA转录和翻译的影响 与对照组 比较 。不 同剂量的大蒜素均明显抑 制肿瘤 V E G F mR N A的转录 ，抑制肿瘤 V E G F的 分泌 ( P0 0 5 ) ， 不 同浓度组 问比较差异有统计学 意 义 ( P0 0 5 ， 表 2 ) 。 2 5 大蒜 素对裸 鼠人神经母 细胞瘤皮 下移 植瘤 MV D的影响 与对照组 比较 不同剂量 的大蒜素均明显减 少神经母细胞瘤 MV D( P0 0 5 ) 。 且不同浓度组问 比较差异有统计学意义( P

9、0 0 5 ， 表 2 ) 。 3讨论 神经母细胞瘤 ( N B) 为A , J L 最常见 的颅外实体 肿瘤 ， 其恶性程 度高 ， 早期 即可发生多部位 、 多系 统转移 ， 手术切 除率低 。N B对常规放射和化 学 治疗不甚敏感 ， 患儿的预后不理想， 其发病率和病 死率居儿童肿瘤前列 ，严重威胁广 大儿童的生命 健康。有必要寻求一种新的、 安全有效的 N B治 表 2 大蒜 素对 裸鼠人神经 母细胞 瘤皮下移植瘤 的影响 Ta bl e 2 I nflue nc e of Al l i c i n on t umor o f nude m i c e b ea r i ng s ub

10、c ut a ne ou s x e nog r af t h um a n ne ur ob l a s t o ma ( 牙 s ， r t =8 ) A NO V A a mo n g a l l g r o u p s ，P0 0 5 ；1 )C o mp e d w i t h a l l i c i n g r o u p I ，PO 0 5 262中山大学学报(医学科学版)第30卷图1人神经母细胞瘤细胞株SK-N-S H形态F ig1Morpholog yofhum anN Bcel ll inesSK-N-SHA：Contr olgroup，100；B：Tr eatedwith

11、al liein40斗gLin4 8h，100图2裸鼠人神经母细胞瘤皮下移植瘤F ig2Nudemicebearings ubcutaneous xenografthumanneuroblastom a(fromleft tofight：al leingroup，al lieingroupIandcontrolgroup)图3裸鼠皮下移植瘤H E染色F ig3Subcutaneous xenografthum anneurob lastomaofnude mice(H E，x200)疗药物，以期改善NB的治疗效果和预后。目前关于大蒜素和NB关系 的研究 尚未见报道，我们选取大蒜素为研究药物，采

12、用体外细胞培养和裸 鼠实验 的方法，观察大蒜素对SKNSH细胞生长 的影响。并探讨其在细胞、蛋白、基因等多个水平上可能 的作用机制，以期为NB的防治做一有益的探索。大蒜素为大蒜鳞茎中提取 的特有 的含硫化合物，近年国内外的流行病学调查和实验表明，大蒜素对多种恶性肿瘤有抑制作用5-83。本实验证实。不同浓度的大蒜素对神经母细胞瘤SKNSH细胞形 态和细胞增殖有 明显影响，10肛g L大蒜素即可抑制SKNS H细胞增殖。并且这种抑制作用，随药物浓度的增加而加强，400btgL以上大蒜素作用48 h可直接杀死肿瘤细胞。在进一步的裸 鼠实验 中我们发现，不同剂量的大蒜素均能抑制裸 鼠人神经母细胞瘤皮下

13、移植瘤的生长，大蒜素处理后的裸鼠皮下移植瘤的体积和质量明显小于对 照组，呈剂量一效应关 系。肿瘤的生长必须依赖血管形成，在缺乏 血管新生的条件下肿瘤仅能生长23m m。V EGF是目前所知作用最强的促血管生长因子，诱导 内皮细胞有丝分裂，增加血管通透性，抑制肿瘤细胞 的凋亡，并能通过诱导巨噬细胞释放血管生长 因子，间接促进血管生成。V EGF对肿瘤的生长、浸润和转移均发挥重要 的调节作用，与肿瘤的临床分期呈正相关关系引 。实验证实NB皮下移植瘤中VEGF呈高表达m。NB患者肿瘤组织的VEGFmR NA亦呈高表达，肿瘤组织表达VEGF的高低与肿瘤分级有关11。本实验中我们运用荧光定量PC R和E

14、 L IS A的方法，定量检测裸 鼠皮下N B的V EGFmR NA的转录量和血清VEG F的浓度，证实运用大蒜素后能够下调NB的转录和翻译，从而抑制N B生长。肿瘤的生长、转移和新生血管 的数量有密切关系，NB中VEGF和MV D均呈高表达挖，V EGF与肿瘤 内MVD呈正相关关系9 。有学者认 为MV D是评价肿瘤组织内血管生成状态以及判断患者预后 的金标准1 3 。本实验运用CD34单克隆抗体及盲法计算裸鼠皮下移植瘤标本的MVD，结果提示大蒜素可以降低人神经母细胞瘤移植瘤的MV D，显示出具有抗肿瘤血管生成 的作用。该结果与肿瘤V E G FmR NA的定量分析和外周血V EGF浓度测定

15、结果一致。上述研究表明。大蒜素对神经母细胞瘤有 明显的抑制作用。作用靶点为抑制肿瘤V EGF的表第 3 期 曾纪晓 等 大蒜素对神经母细胞瘤生长的抑制作用 2 6 3 达， 为我们治疗 N B提供了一个新的可能， 但要想 使其真正应用于临床并使 N B患儿受益 。还需要 开展更广泛更深入的研究 。 参考文献： 2 3 4 5 6 檀卫平， 见须英雄， 马渊理 神经母细胞瘤 6 0例预后 因素分析 J 中山大学学报 ： 医学科学版 ， 2 0 0 3 ， 2 4 ( 1 ) ： 9 2 9 6 郑磊， 孙晓非 ， 甄子俊 ， 等 神经母细胞瘤患者血清 神经元特异性烯醇化酶水平变化的临床意义附 5 0例报告 J 新医学，2 0 0 8 ， 3 9 ( 1 0 ) ： 6 4 4 6 4 6 朱明亮， 朱云发 颅鼻沟通嗅神经母细胞瘤 1 例及文 献复习 J 中华神经 医学杂志 ，2 0 0 3 ， 2 ( 3 ) ： 2 2 9 23 0 K wo n KB， Yo o S J ， Ry u D G， e t a 1 I n d u c t i o n o f a p o p