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1、第3 7 卷第2期199 8年4月复旦学报(自然科学 版)Jo u rn alofFuda nUnive rsity(Natu ral Scle n ee)Vol. 37Al r.No. 2199 8两歧双歧杆菌培养基成分的改进关居述林王 雪奇马 向前周德庆(微 生 物学和微生物工程系)提要根据双歧杆 菌的特 殊生长 要求及培养基的设计原则,在比较3 0余种现有 双歧什 凶与乳酸 菌 培 养基 的基础上,设计了B IB培 养 基,并 通 过选择BIB中最适蛋 白陈品种 及增 加 适量 泡菜汁,改进B IB为B IB一1.结果表明:每 毫升B IB一l培养基 培养两歧双歧杆 菌ATC C 295
2、2 1所得的最高活菌数约 为其他 培养基的1 03 0倍.此外,还证明 了研 究 中选用的“胰蛋 白脉”所含的游 离天冬 酞胺、谷 氨 酸、鸟 氨 酸和瓜氨酸 是 促 进 两歧双歧杆 菌A T C C2 95 21生 长的重 要因子.关键词培养基;两歧双歧杆菌;蛋 白陈;泡菜汁中图法分类号Q93一33 5自1 8 9 9年T is ser从 健 康母 乳喂养 的婴儿 粪 便 中 分 离到双歧 杆菌后,由于它具有很强 的保 健作用川,一直吸引着细菌学家、医学 家和营养 学 家们的 兴趣.经过近百年的研究,双 歧 杆菌早已被制成药品和不同类型的微生态 调节剂.由于双歧 杆菌生长较慢、严格 厌氧和不
3、易保 藏等原因,使得 它 的应用受 到一定的 限制.长 期以来,如何 改善 双歧 杆 菌的 培养条 件一直是双歧 杆菌研究 的一个重点,而培养基则是培养条件 中一个很 重要的方面.本文以典型的两歧双歧 杆 菌为对 象,对其 培养基成分 作了若干较 有意义的改 进.1材料和方法1.1材料菌 种:两歧双歧 杆 菌(Bl f ido b a cte ri umbi f id“m)ATCC29 521;培 养基:VL培 养基川,LA B培养 基川,MR S培 养基川,BI B培 养基;蛋白脉:普通 蛋 白脉( P即t on e,上 海东海制药厂),胰蛋 白陈(Tryptone,上海东海 制 药厂),酪
4、蛋 白陈(Ca seinPepto n eUS AICN,进口分装),月 示蛋 白陈(ProteosePepto ne,上海东 海制药厂),植陈(Phytone,上海新兴医药 保 健品科 技开发 中心化 工 试剂 部),多 聚蛋白陈(Po lyP ept one,浙 江玉环红星生化 制品厂);厌 氧培 养装 置:8 2 5一A型厌 氧 罐(沈阳第五人民 医院生产),亨盖 特 试 管及丁基橡 胶 塞;仪器:pHS一3 DC精密数显酸度计,LKB4 15 1氨基 酸 自动分析 仪.收稿日期:1 99 7一03一05第一作者 居 述林,男,19 7 3年生,硕士研究生;联系作者 周 德 庆,教授;复
5、旦大 学 微生 物和微生物 工程 系,上 海20 04 3 3,上 海 市高等学 校科学技术 发 展 基 金资助课题第2期居 述林等:两歧双歧杆菌培养基成分的改 进1.2方 法双歧杆 菌培 养方 法( I )菌种活化:取少量 菌种接 人 装有gm1B IB培养基 的亨盖特试管 中,然 后抽 气、充 氮,重复3次后,置3 7厌 氧 培养 2 4h.(2 ) 在亨盖特试 管 中加 人9ml所测培养 基,接1m l活化菌液,置3 7C厌氧 培养,方法 同上.双歧 杆 菌计数 方法:用改进的马一周 试管 计数 法川,根据试 样 中含菌量的大 小,前几 支试 管以0.9%生理盐 水代替 半固体 培养 基
6、.泡 菜汁的制 作:用清水 洗净 新 鲜 胡萝 卜表面,再用 温开水洗3遍,切成片;把它 与 温开 水 配制 的2%NaC I溶液1:1放人干净的 泡菜坛中,液面距 坛口约23cm左右,加盖,用水封口;3 7培养 3 6h后,取 泡菜 汁.2结果2.1BIB培养基与L A B,V L和 MRS培 养基 的比较根据双歧杆菌 特殊生长要求闹及 培 养基 设计原则 7 j,我们在比较 3 0余种文献 中常用的双歧杆 菌和乳酸菌培养 基闭的基础上,设 计了以下B IB培养基,其成分 为:葡萄糖 1 09,乳糖109,胰蛋白陈109,酵母 膏69,牛肉膏69,MgSO47HZO0.59,吐温一501ml
7、,泡菜 汁15m l,NaZH PO;ZHZO10 名,KHZPO46 9,加蒸馏 水至1 0 00m l,pH7.0.以BIB为基础,与常用的LAB,VL和MR S作比较,结果见图1,图2.由图 可看 出,用B IB培养基 培养两歧双歧 杆 菌A TC C2 9 521在达到 稳 定期 时,其活菌数(1.3 1x10 5 )高于其他3种 培养基,pH值下降也较 慢,所以B IB培 养基 更适合于该菌 株的生长.毗L A B毗V L一一峨.一 B I B 尸丈一VL一艺卜LA B门一例卜-MR S 毛、三己留一乙一晚日2一卜“盛么了二八己LU, 曰5犷一一寸一不犷一亥一飞犷一写犷一碗t/h图I
8、Ar CC 艺 9 5艺1菌 株 在B IB,LAB,MRS和VL培 养 基 中的生 长曲线图ZA 丁C C艺 9 521菌 株在B IB,LA B,MR S和VL培养基中pH值的变化2,2不 同蛋 白膝对A TCC2 9 5 21菌株生 长的影响在BIB培养 基 中,分别用6种不 同的蛋 白陈:普通蛋 白陈(PE),胰蛋 白陈(T R),酪蛋白 陈(CP),月 示蛋 白陈(PP),植 陈(PH),多 聚 蛋 白陈(PO),培养AT C C29 521菌株2 830h,计 数结果见表1.从 表1看出,其 中以胰 蛋 白陈作用 最好,故在以下实 验 中,B IB中的 蛋白陈均采用胰蛋白陈.复旦学
9、报(自然科学版)第37卷表1不同蛋白膝对A T CCZ ,52 1菌株生长的影 响10了efu/ml蛋 白陈活菌数2.34种 特有氨 基酸 对A TC C2 952 1菌株生 长的 影响我 们选 择胰 蛋 白脉 与普通 蛋 白脉,分别 进行 氨基 酸 自动分 析,发现胰蛋 白脉 中含 普通蛋 白脉 所没有的游 离天冬 酞胺、鸟氨 酸和瓜 氨 酸,谷氨 酸含 量 也远高于普通 蛋 白陈,结果见 表2 .根 据 表2的数据,我们以含 普通 蛋 白陈的B IB 为对照,然 后在每 升培 养液 中分 别 加入5 2.14mg天冬 酞 胺、5 3.24mg鸟 氨酸、8 9.1 9mg瓜 氨酸和32.7
10、2mg谷 氨 酸,培 养A TC C2 9 521,结 果 见 表3.由表 看 出,鸟氨 酸、瓜 氨酸明显促 进ATCC2 952 1生长,每 毫 升培 养 液 所得的活菌 数分 别 为对照 的6.6与8.0倍;若 同时 加人 鸟氨酸和瓜 氨酸,活菌数可提高 1 8倍;如 同时加入4种氨 基 酸(A+O+C+G),活 菌数更可提高 2 2倍.衰2普通蛋白膝和胶 白膝中4种特有氮荃酸含,的比较mg/g蛋白陈氨基酸氨基酸谷氨酸0.294天冬酞胺鸟氨酸瓜氨酸普通 蛋 白陈胰蛋 白脉3.56 65.2145.3248.919注:本表仅选含量差别明 显 的4种 氨基酸数据.表3不 同氮基 酸对AT C
11、C Z,52 1生 长的影晌107efu/m l氨基酸活菌数对照GAOCA+CC+OA+OA十O十CA+O十C+G2.71.97.38.61 820721G:谷氨酸A:天冬 酞胺0:鸟氨酸C:瓜氨酸.2.4泡 菜汁对A TCC2952 1菌株生 长的作用我 们 在B IB培 养 基 中 分 别 加 人1%、1.5%、2% 泡 菜汁,观 察 其 对两歧 双 歧 杆 菌ATCC2 9 52 1菌 株生 长 的影 响,结果 见 表4.表4泡菜汁对A TC C Z , 52 1菌株的生长 促 进 作用108efu/mlB IB+泡菜汁(PC Z)BIBBIB+l%PC ZB IB+1.5%PC ZB
12、IB+2%PC Z活 菌数4.175.255.19由表 看出,不 同浓度的 泡菜 汁 对ATC C29 52 1菌株的生长都 有 促进 作用,但1.5写浓度最 合适,它比对照 的c fu/ml数 提高1.7倍.因此,在以下的 实验中,我们在B IB培养 基第2期居 述林等:两歧双歧杆菌 培养基成分的改进中加1.5%的泡 菜汁,并将这种新 培养基 命名 为B IB一1培养基.(工三/,)场01月 才O2.5B I B一1与BI B两种培养基的比较由图3可以看出B IB与BI B一1缓 冲 能 力相近,但在 相同 培 养条 件下,后者每 毫升 所得最 高活菌 数是前 者的4.8倍,因此B IB一1
13、更有 利于毛ATC C2952 1的生长.3讨论用于培 养双歧 杆 菌的 培养 基 应注意:(1 )营 养 成 分 合适;(2)较 好的缓 冲能力;(3)适 当的pH;(4 )较低的氧 化还4占, 合一BI B -令分一 B IB+PC 一或卜一BIB 州一B I B+PC l12243648t/h图3ATCC295 21菌株 在BIB和B IB一l培养基 中pH值和 活菌数的变 化原 电势 8 j.学者 们正是 这样 考虑的,如LA B培 养基 中加CaCO3,主要作用是 中和双歧杆 菌生 长代谢过程中产生的酸;B L培 养基和VL培 养 基 中加入L一半 胧 氨 酸盐 酸 盐可降低 氧化还
14、 原 电势,维持 较好的无 氧环境;还有 在培 养 基 中加入了生长 促进 物质,如 人 奶和牛奶乳 清、多 种寡糖、猪 胃粘 液、牛血清、白蛋 白水解 液、肝浸汁或N一乙酞 葡 糖胺 2 ,9,等等.结果发 现它们在一定程度上都有利于双歧 杆 菌的生 长.我们正是以此为原则设计了B IB一1.通过比较“胰 蛋 白陈”与“普通蛋白脉”等6种 不同市 售蛋 白脉对ATCC2 9 5 2 1生 长 的不同作用,并用氨基酸 自动分 析 仪对 两 种影 响生 长 量 最 明显的 蛋 白脉的 游离氨基酸进行测定后,发现天冬酞胺、谷氨酸、鸟氨酸和瓜 氨酸都 不 同程度地促进两歧双歧杆 菌 的生长,尤以鸟氨
15、酸与瓜氨酸最为显著.Rayn aud等(1 9 59 )发 现川,酪 蛋 白等蛋 白质分 解形成的 蛋白陈样物 质对两歧双歧 杆菌的生长有 促进作用,当时对 此物质化学成分及性质还不了解,他 们称此类物 质 为双歧 杆菌因子1.我们 认 为,此双歧杆 菌因子I可能就是鸟 氨酸、瓜氨酸等游离氨基酸之类的成分.从应用角度 来看,纯双歧 杆 菌生长因子 一般价 格较 高,人 们希望从 自然界 广泛存在 的天然材料 中寻找.为此,我们 考虑了泡菜,因为在 制 作泡菜的 原材 料中往往含丰 富 的维生素 及可能存在寡糖和氨 基酸等双歧 杆菌生长促 进因子;泡菜 中所 含 的乳酸菌 菌 体本 身可能 也
16、含促进 双歧杆 菌 的生长因子.经过 对比实 验,表 明 泡菜汁 对两 歧双歧 杆 菌ATC C2 9 521的生长 确实具有明显 的促进作用.此外,作 者还分 别用 泡菜 汁、泡菜汁 中的菌 体及泡菜汁 离心后的上清液 做了比较 实 验,发现 泡 菜 汁 中的菌体可使AT CC29 521的生长 速度 加快,而离心并灭 过菌的上清液则可提高 双歧 杆菌的数量.本 实验用 的是以胡萝卜 为 原料 制作的泡菜 汁,经试验也可用以包心菜为原料 制作的泡菜 汁代 替.两歧 双歧杆 菌是 人 体 内存在的主要双歧杆 菌 之一,通过本工作 也初步证明吃 泡菜可能有助于促进肠 道内有益菌群的生长并进而 调整 肠道菌 群的平衡.若 能深 人分 析泡菜 中的化 学成 分 并扩 大19 0复旦学 报(自然科学版)第3 7卷所 试 菌种 将会对 双歧 杆菌生长促进物 质 的本质 有进一步的 了解.参考文献123456789Gibso nG R,WangX.Regulatoryeffe etsofbifidobaete riaonthegrowth