基因表达谱分析技术

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1、基因表达谱分析技术基因表达谱分析技术1 1 微阵列技术（微阵列技术（microarraymicroarray） 这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA 序列 多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。其原理基本是利用光导化 学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸 “探针” （cDNA、ESTs 或基因特异的寡核苷酸） ，并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同 细胞、组织或整个器官的 DNA 或 mRNA 反转录生成的第一链 cDNA 进行杂交，然后用特殊的检 测系统对每个杂交点进行定量分析。其优点是可

2、以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因 表达进行对比分析。包括 cDNA 芯片（cDNA microarray）和 DNA 芯片（DNA chips） 。 cDNA 芯片使用的载体可以是尼龙膜，也可以是玻片。当使用尼龙膜时，目前的技术水平 可以将 20000 份材料点在一张 12cm18cm 的膜上。 尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了 的双链 cDNA 片段。要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。杂交的 结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样 品中表达模式存在差异的基因。杂交使用的探针一般为 mRNA 的反转录产物，标记探针使用

3、 32PdATP。如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。杂交时使用两种不同颜色的荧光 标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂交。洗去未杂交的探针以后， 能够结合标记 cDNA 的点受到激发后会发出荧光。 通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强 度。对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。 一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色 的点代表在不同样品中其丰度各不相同。 使用尼龙膜为载体制作 cDNA 芯片进行研究的费用要 比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。检测两种不同的组织或相同组织在不同条件下基

4、因表 达的差异，只需要使用少量的尼龙膜。但是利用玻片制作的 cDNA 芯片灵敏度更高，而且可以 使用 2 种探针同时与芯片杂交，从而降低了因为杂交操作带来的差异；缺点是无法重复使用 还必须使用更为复杂的仪器。 Guo 等（2004）将包含 104 个重组子的 cDNA 文库点在芯片上，用于检测拟南芥叶片衰老 时的基因表达模式，得到大约 6200 差异表达的 ESTs，对应 2491 个非重复基因。其中有 134 个基因编码转录因子，182 个基因预测参与信号传导，如 MAPK 级联传导路径。Li 等（2006） 设计高密度的寡核苷酸 tiling microarray 方法，检测籼稻全基因组转

5、录表达情况。芯片上 包含 13,078,888 个 36-mer 寡核苷酸探针，基于籼稻全基因组 shot-gun 测序的序列合成， 大 约 81.9%（35,970）的基因发生转录事件。Hu 等（2006）用含有 60,000 寡核苷酸探针（代表 水稻全部预测表达基因）的芯片检测抗旱转基因植株（过量表达 SNAC1 水稻）中基因的表达 情况，揭示大量的逆境相关基因都是上升表达的。2 2 基因表达系列分析（基因表达系列分析（SerialSerial analysisanalysis ofof genegene expression,expression, SAGESAGE） 基因表达系列分析（

6、SAGE）是一种转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的快速、 有效的技术，也是一种高通量的功能基因组研究方法，它可以同时将不同基因的表达情况进 行量化研究（Velculescu et al., 1995） 。SAGE 的基本原理是：每一条 mRNA 序列都可以用 它包含的 9bp 的小片段（TAG）代替，因此考查这些 TAGs 出现的频率就能知道每一种 mRNA 的丰度。首先利用生物素标记的 oligo （dT） 引物将 mRNA 反转录成双链 cDNA， 然后利用 NlaIII 酶切双链 cDNA。NlaIII 酶的识别位点只有 4bp，因此 cDNA 都被切成几十 bp 的小片段。带有

7、生物素标记的小片段 cDNA 被分离出来，平均分成 2 份。这 2 份 cDNA 分别跟 2 个接头连接， 2 个接头中均有一个 FokI 酶切位点。FokI 是一种 II S 型核酸内切酶，其识别位点不对称， 切割位点位于识别位点下游 9bp 且不依赖于特异的 DNA 序列。FokI 酶切分成 2 份的 cDNA 之后，带有部分接头序列的 TAGs 就被释放下来。这时将 2 份 cDNA 混合起来，进行连接反应。 根据接头序列设计引物扩增连接反应的产物， 然后通过 NlaIII 酶切 PCR 产物得到连接在一起 的两个 TAG，即 ditag。将 ditags 串连起来，克隆到质粒载体中。一

8、般每个克隆包含 50 个左 右的 ditags。这些克隆经过 PCR 扩增然后测序。因为每一个 ditag 之间都是以 NlaIII 识别 位点间隔的， 所以很容易对每个的 ditag 进行区分和计数。 而每一个 TAG 在 SAGE 库中出现的 频率就代表了该基因的表达水平。 利用 SAGE 可以在短期内得到丰富的表达信息， 与直接测定 cDNA 克隆序列方法相比，减少了大量的重复测序，从而大大节省了研究时间和费用。这种方 法对正常、癌基因旁、癌组织中基因的差异表达研究方面还有独到的优点，有助于发现肿瘤 特异基因。 首次运用 SAGE 技术是分析 1000 个胰腺基因的表达情况（Velcul

9、escu et al., 1995） ， 结果都显示它是一种有效的功能基因组研究方法。 最早用 SAGE 技术进行研究的高等植物是水 稻（Matsumura et al., 1999） 。运用 SAGE 技术检测了水稻中来源于 6000 个基因 10000 个 TAGs。SAGE 分析显示绝大部分高表达基因都是看家基因，这些基因的 mRNA 在总 RNA 中的比 例超过 1。 在无氧处理和对照的幼苗中分析了 2000 个左右的 TAGs， 结果显示多数基因的表 达没有变化。有趣的是，发酵途径相关的基因同样没被检测到。根据 TAG 序列设计引物，成 功扩增出了延伸因子 EF-1a 0.2kb 的

10、 cDNA 片段。这一事实说明利用 9bp 的 TAG 序列和 4bp 的 NlaIII 识别位点序列，可以设计引物用于长片段 cDNA 的获得。3 3 cDNA-AFLPcDNA-AFLP cDNA-AFLP 是从基因组 AFLP 方法（Vos et al., 1995）发展来的 RNA 指纹技术。经典的 cDNA-AFLP 按照标准的 AFLP 方法进行操作， 只不过模板变成了 cDNA。 这一方法包含 3 个步骤： a.将 cDNA 酶切并连上载体；b.利用包含选择性碱基的引物进行扩增；c.电泳及成像。一般选 择两种限制性内切酶进行 cDNA 的消化，这两种酶一种的酶切位点为 4 个碱基

11、，另一种为 6 个碱基。在植物基因组的 AFLP 操作中，需要添加 3 个进行选择性扩增。因为 cDNA 的复杂性 比基因组低，所以 cDNA-AFLP 中每个引物只需要 2 个选择性碱基。聚丙烯酰胺凝胶电泳中， 最大的 cDNA-AFLP 产物为 1000bp 左右，最小将近 100bp。对马铃薯的已知 cDNA 序列分析发 现，cDNA-AFLP 中常用的两种酶只能同时切割大约 45的 cDNA。如果使用这种方法，几乎一 半的基因的表达情况是无法被揭示出来的， 因此对 cDNA-AFLP 方法进行了修改， 在 cDNA 的酶 切时仅仅采用单酶切，这就是单酶切的 cDNA-AFLP 技术（H

12、abu et al., 1997） 。1999 年， Kawamoto 等人进一步发展了这项技术，他们称之为 iAFLP 技术。利用该技术可以同时检测多 个样本的基因表达差异。 cDNA-AFLP 技术在植物中的首次运用，是 Bachem 等（1996）对马铃薯基因表达差异的研 究。 该研究分离到两个在马铃薯块茎形成过程中差异表达的 cDNA 片段。 这两个基因的转录都 是块茎特异性的；它们在 15 天的块茎中高度表达，但在其它组织中表达量很低。此后无论在 分离抗逆相关基因的研究也有成功的报道（Ivashuta et al., 1999） 。4 4 差异展示差异展示 PCRPCR（Differ

13、entialDifferential DisplayDisplay ReverseReverse TranscriptionTranscription PCR,PCR, DDRT-PCRDDRT-PCR） DDRT-PCR 是基于反转录和 PCR 的功能基因组研究方法，最早由 Liang 和 Pardee（1992） 报道。这种方法能有效地检测真核细胞中特定基因的表达模式，因而可以用于发现和克隆新 的基因。DDRT- PCR 技术的基本原理是扩增反转录产物得到分子量大小不同的 cDNA 片段。 首 先利用 oligo（dT）引物反转录 mRNA 得到 cDNA，然后利用相同的 oligo（dT

14、）引物和另一随 机引物进行 PCR 扩增。到目前为止该技术已经得到了大量的改进。为了提高特异性，可以增 加随机引物的特异性。碱基数增加以后，有可能包含某一特异基因家族的保守序列，这使得 检测某一类基因的表达情况成为现实。 分离 DDRT-PCR 的产物简单易行， 可以通过变性或非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（Liang et al., 1995） 、毛细管电泳（George et al., 1997）或 普通琼脂糖电泳获得。DDRT-PCR 产物的标记，可以使用33PdATP（Simon and Oppenheimer, 1996） 、荧光（Jones et al., 1997）或银染（Gotts

15、chlich et al., 1997） 。 因为这种方法非常简便，所以它得到了广泛的应用。自从该方法被发明以来，已有许多 成功的报道， 应用范围包括从微生物到人类的各个物种。 在植物中运用 DDRT-PCR 方法得到了 大量的 cDNA 克隆，从拟南芥中得到了一些控制生物钟的基因（Kreps et al., 2000） ，从大 麦野生型品种和无根毛的突变体中克隆了一个控制根毛形成的基因 HvEXPB1（Bratanich and Blanchetot, 2006） 。该技术在生物对逆境条件适应的研究中同样得到了广泛的应用，为了弄 清楚在多系统衰竭综合症中猪圆环病毒型侵入时发生的细胞学事件，

16、利用 DDRT-PCR 鉴定了 一些淋巴细胞内受此病诱导而的靶分子，其中两个差异调节转录本显示与人的基因有一定同 源性，分别是 RNA 剪接因子和透明质酸介导的运动受体（Kwasniewski and Szarejko, 2006） 。5 5 抑制消减杂交（抑制消减杂交（SuppressionSuppression SubtractiveSubtractive Hybridization,Hybridization, SSHSSH） SSH 方法是一种简便而高效地寻找差异表达基因的新方法。该方法是以抑制 PCR 为基础 的 cDNA 消减杂交方法。所谓抑制 PCR，是利用非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火 时产生“锅柄”结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制非目标序列的扩增。SSH 方法既 利用了消减杂交技术的消减富集，又利用抑制 PCR 进行了高效的复性动力学富集。其全部流 程包括 4 个主要步骤： a.分别反转录 tester 和 driver 的 mRNA 得到双链 cDNA， 然后利用 RsaI 酶切 cDNA，并将酶切的 tester cDNA 加