《甘露聚糖结合凝集素调节获得性免疫应答的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《甘露聚糖结合凝集素调节获得性免疫应答的初步研究（138页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、博士学位论文甘露聚糖结合凝集素调节获得性 免疫应答的初步研究博士研究生：王明永指导教师：陈政良教授摘要甘露聚糖结合凝集素( m a n n a n - b i n d i n gl e c t i n ，M B L ) 是由肝细胞产生的血浆蛋白，为C 型凝集素超家族中胶凝素( c o l l e c t i n s ) 家族成员，具有补体C l q 的“郁金香“ 样结构。成熟M B L 肽链自N 端至C 端依次有4 个结构域：富含C y s 的N 端区、胶原样区( c o l l a g e n 1 i k er e g i o n ，C L R ) 、颈区和C 端糖识别域( c a r b
2、o h y d r a t e r e c o g n i t i o nd o m m n ，C R D ) 。人的完整M B L 分子是同质三肽链 结构单位的寡聚体，多至六聚体。只有高寡聚体M B L 分子才具有生物学活性。M B L 可选择性识别多种病原体的糖结构，通过激活补体凝集素途径而发挥溶破和间接调理功能，并能与吞噬细胞胶凝素受体( 即C l q R ) 结合而启动调理吞噬，还可介导M B L 依赖的细胞介导的细胞毒作用；而且，M B L 也是一个重要的粘膜表面防御分子。多种著名杂志如S c i e n c e 、J o u n a lo f I m m u n o l o g y
3、 等刊文称M B L为“天然免疫系统中的关键分子，凝集素途径是“天然免疫的关键成份“ 。十余年来，随着对天然免疫研究的深入，特别是初步研究提示天然免疫对获得性免疫应答还有一定的影响，人们对天然免疫系统的传统认识发生了根本性的转变。现代免疫学认为，天然免疫系统不仅仅能够通过诱导必要的急性反应来清除病原微生物，而且还能够通过配体识别和分泌细胞因子等方式触发适当的获得性免疫应答，并认为天然免疫系统对外来入侵病原体的初次应答状态，决定了后续获得性免疫应答的性质。天然免疫模式识别受体( p a t r o nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r ，P R R ) 通过
4、分析外来入侵病原体的危险程度，启动对宿主的保护程序。单核细胞( m o n o c y t e ，M o ) 、巨噬细胞( m a c r o p h a g e ，M g ) 及树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ，D C ) 作为某些应答的直接介导者，能够感知外来危险信号并在其刺激下分泌一些炎性细胞因子，细胞因子环境进一步影响后续的获得性免疫应答。正常情况下，机体天然免疫分子能够清除自身凋亡的细胞或坏死的组织进行组织修中文摘要复，维持机体代谢平衡，因此在没有危险信号情况下，天然免疫分子能够通过鉴别自身凋亡细胞，避免诱导一些能够引起自身免疫病的获得性免疫应答，扮演
5、获得性免疫应答调节者的角色。现已发现，胶凝素家族的其他成员如肺表面活性物质蛋白A 和D ( s u r f a c t a n tP r o t e i nA 、s u r f a c t a n tp r o t e i nD ，S P A 、S P D ) 及补体C l q 具有多种免疫调节功能，如S P A 能够抑制D C 的成熟和分化，通过与C D l 4 分子相互作用触发细胞应答，并能够抑制脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，L P S ) 诱导的单核巨噬细胞分泌T N F a 等细胞因子，还可以直接与T o l l 样受体- 4 (
6、T o l l 1 i k er e c e p t o r 4 ，T L R 4 ) 、M D 2 分子相互作用来调节炎性细胞反应；S P D 能够加强抗原提呈；C l q 则可以直接调节D C 的成熟与分化并能够抑制L P S 诱导的细胞因子产生。M B L 作为天然免疫的关键分子，已被报道能够调节多种细胞因子的表达，但是到目前为 止，对M B L 在获得性免疫应答中的作用几无所知。根据M B L 与S P - A 、S P D的同源性、都能与胶凝素受体结合及已发现M ( p 表达特异性胶凝素受体并介导多种免疫调节功能的情况，推测M B L 必定参与获得性免疫应答。针对此设想，本课题组陈月
7、博士已经作了大量相关研究，并得出结论：M B L 对D C 的分化成熟有一定的影响。联想到D C 作为机体内最重要的抗原提呈细胞( a n t i g e n p r e s e n t i n gc e l l ，A P C ) 在启动获得性免疫应答起着关键作用，提示M B L 极有可能参与调节获得性免疫应答。因此，在现有研究基础之上，本课题继续探讨M B L 在调节获得性免疫应答中所扮演的角色。我们首先联合应用配体和抗体亲和层析柱子，从人新鲜冰冻血浆中提取高纯度的具有生物学活性的天然M B L ，并原核表达了可溶性T L R 4胞外段蛋白( S T u M ) ，然后对M B L 负向调控
8、L P S 诱导的D C 功能效应做了初步的机理分析：又选择人B 细胞系R a j i 细胞作为研究对象，分析M B L 与其相互作用的特性及其对细胞功能的影响；又原核表达了模式抗原破伤风毒素C 蛋白( T T C ) ，探讨了M B L 对P H A 、P M A 或P M M i o n o m y c i n 活化的人T 细胞系J u r k a t 细胞、外周血单个核细胞( p e r i p h e r a lb l o o dm o n o e u e l e a rc e l l ，P B M C ) 、外周血新鲜分离的C D 3 + T 淋巴细胞的增殖及分泌细胞因子的影响，并分
9、析了M B L对D C 提呈T T C 抗原能力的影响。本研究分4 部分，兹分述如下。一、联合应用配体和单克隆抗体亲和层析纯化人血浆天然M B L 蛋白博士学位论文M B L 是天然免疫系统的一个重要分子，许多有关凝集素途径及其相关疾病的理论研究、临床疾病病人血清中M B L 水平测定和抗M B L 单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ，m A b ) 制备等实际工作中，都需要高度纯化的M B L 制剂。然而，血浆中M B L 浓度很低，正常人在4 0 - 3 5 0 0p g L 之间，平均约9 0 0p g L ，血浆成份又非常复杂，获得高纯
10、度M B L 比较困难。为获取高纯度天然M B L ，本研究优化了传统提纯M B L 的方法。制备了抗人M B L C R Dm A b S e p h a r o s e4 B 亲和层析柱，联合采用配体甘露聚糖S e p h a r o s e4 1 3 亲和层析柱，将预处理人血浆3 次上柱亲和层析分离，分别用E D T A 、D 甘露糖、G l y o H C I ( p H2 4 ) 溶液洗脱结合蛋白。以S D S P A G E 、W e s t e r nb l o t 和E L I S A 等技术鉴定纯化产物。试验结果显示，所获纯化M B L 为2 8K D 和3 2K D肽链构成
11、的功能性寡聚体，其纯度较高，可与配体甘露聚糖结合并有效凝集酵母菌，还能与U 9 3 7 细胞胶凝素受体结合。本文报道的血浆预处理技术然后采用甘露聚糖一S e p h a r o s e4 B 亲和层析柱和抗人M B L - C R Dm A b S c p h a r o s e4 B 亲和层析柱联合层析技术，可以获得高纯度、高活性的M B L 蛋白，为后续研究奠定了坚实的物质基础。二、M B L 调节D C 功能的机制初步研究T L R 是天然免疫系统中重要的模式识别受体，不仅能够介导对病原微生物及其产物的识别，而且能够参与获得性免疫应答，被视为联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。在所有的T L
12、 R 家族中，T L R 4 在未成熟D C ( i m m a t u r ed e n d r i t i cc e l l ，i m D C ) 、M o 及M o p 广泛表达，而且在识别L P S 及其所介导的信号途径中起着关键作用。本课题组陈月博士研究发现，M B L 对L P S 诱导的i m D C 的成熟、细胞因子产生具有负向调控作用，但其作用机理并不明了。本研究继续陈月博士的工作，以T L R 4 为切入点，探讨M B L 对L P S T U 介导的信号途径的影响，进一步分析M B L 对D C 功能调节的机理。实验中首先原核表达了可溶性T L R 4 胞外段蛋白( s
13、T U H ) ，以蛋白质印迹试验( W e s t e r nb l o t ) 鉴定其特异性；接着用W e s t e r nb l o t 和E L I S A 两种方法分析M B L 是否与s T L R 4 相互作用，并用流式细胞术( F C M ) 分析M B L 与i m D C的结合情况，竞争性抑制试验分析M B L 是否结合i m D C 表面的T L R 4 受体及影I l l中文摘要晌后续L P S T L R 4 介导的信号途径。实验结果显示：( 1 ) M B L 可以直接以浓度依赖方式与可溶性T L R 4 蛋白胞外段结合：( 2 ) M B L 能够以C a 2
14、+ 依赖方式结合i m D C ，这种结合能被s T L R 4 蛋白及抗T L R 4m A b 所抑制；( 3 ) M B L 能够竞争性抑制L P S 结合i m D C ；( 4 ) M B L 能够抑制L P S 诱导的核转录因子- r B( n u c l e a rf a c t o r - r , B ，N F r B ) 活性。资料表明，M B L 可通过结合i m O C 表面T L R 4受体来调节L P S T L R 4 介导的信号通路，提示M B L 和T L R 4 之间存在联系，在免疫调节中扮演重要的角色。三、M B L 对R a j i 细胞作用特性的研究作为
15、关键的天然免疫分子之一，M B L 还能以钙离子依赖、糖特异的方式结合自身的M o 、D C ，影响细胞因子的表达，提示M B L 在免疫调节中发挥重要作用，并极有可能参与获得性免疫应答。前文报道了M B L 对D C 的调节作用，而T 、B 淋巴细胞是获得性免疫应答的介导者，但迄今未见M B L 直接与淋巴细胞相互作用而参与调节获得性免疫应答的报道。因此，研究M B L 与淋巴细胞之间的相互作用具有重要意义。本实验中，我们选择人B 淋巴系R a j i 细胞作为对象，研究M B L 是否与其结合及其结合特性，并对这种相互作用的后果进行了简单分析，为探索M B L直接参与B 细胞介导的获得性免
16、疫应答提供初步的依据。实验中首先采用细胞E L I S A 方法分析M B L 能否与R a j i 细胞结合，并采用F C M 着重研究其与R a j i细胞结合特性。结果显示，M B L 以浓度依赖方式结合R a j i 细胞；M B L 与R a j i细胞的结合是C a 2 + 依赖的，且能被甘露糖、葡萄糖、N 乙酰葡糖胺所抑制；C l q或抗C l q Rm A b 能部分抑制M B L 与R a j i 细胞结合：重组人M B L C R D 蛋白或M B L - C L R 蛋白均能抑制M B L 与R a j i 细胞结合，两者联合应用则可完全阻断这种结合。资料表明，B 淋巴细胞系R a j i 细胞表达C a 2 + 依赖性、糖敏感的M B L受体( 或结合蛋白) ，包括对C L R 特异和C R D 特异的两种受体，前者为M B L和C l q 的共同受体。进一步的功能研究显示，高浓度M B L ( 1 0 - - 5 0m g L ) 对R a j i 细胞的生长具有明显抑制作用，且呈剂量依赖关系。提
