《N乙酰氨基葡萄糖转移酶V对细胞信号转导和基因调控的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《N乙酰氨基葡萄糖转移酶V对细胞信号转导和基因调控的影响（90页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、N 乙酰氨基葡萄糖转移酶v 对细胞信号转导 和基因调控的影响摘要N ，乙酰氨基葡麓糖转移酶v ( G n 孓v ) ( E C 2 4 1 1 5 5 ) 是分布在离尔基体中的一种重要的N 糖链加工酶，它以U D P G l c N A c 为供体底物，将G I e N A c 基团转移至受体N 一糖链核一I j , c t l ，6 臂的甘露糖( M a n ) 上，形成G 1 e N A c l 3 1 ，6 M a n 分支结构，主要分布在小肠，脑和肺等组织。人类G n T V 由7 4 1 个氨鼙酸组成，有6 个潜在的N 糖基化位点，基因定位于染色体2 q 2 1 ，含有1 7 个外显
2、孑，其开放阅读框架出外显予2 - 1 7进行编码。G n T V 在很多恶性肿瘤中都有过量表达，其产物复杂型N - 糖链D 1 ，6G I c N A c分支的增多可能是肿瘤发展和转移潜能的重要特征。本实验室对G n T V 的研究已有多年，毽我们发现G n T - V 的功能尚有缀多阀题未解决。本文黻稳定转染G n T V 正义或反义e D N A 质粒的H 7 7 2 1 人肝癌细胞为材料，从下列四个方匿对G n T - V 影响信号转导及其机制以及日I 起基因表达的变化进行了研究，企图阐明糖蒸转移酶转染是怎样调节细胞信号转导的? 而细胞信号转导的改变是否与细胞表面某些受体的糖链结构的改变
3、( 囱G r i T V 的正义或反义e D N A 转染引起的) 有关? 能秀影蛹细胞基因表达?这些问题的阐明不仅有利于进一步认识G n T V 的功能，而且为胂瘸转移的分子机理提供有价值的资料。第一部分G n T V 对H 7 7 2 1 细胞生长、E G F 敏感性和E G F 受体的影响用M T T 方法发现转染正义G n T Ve D N A 的H 7 7 2 1 细胞增殖遽度加快，而且无沧楚3 H T d R 的总参入量或每个缅臌的参入量均见臻翻，说明D N A 舍戒增强，两转染反义G n T V c D N A 的H 7 7 2 l 细胞则完全相反，D N A 合成和细胞增殖速度
4、均见降低，这提示G n T V 可调节细胞的生长。G n T V S H 7 7 2 1 细胞的生长对表皮生长因子( E G F )露l 激比M o c k 纲匏敏感，衙G n T V A S H 7 7 2 l 细胞对E G F 敏感性则低于M o c k 缩胞。因此本文对不同转染缨腿E G F 受体( E G F R ) 的耱链结构及功能的改变作进一步研究，结粜发现，不闹转染细胞中，兔疫沉淀E G F R 的蛋白量没有改变，但G n T V S H 7 7 2 1细胞E G F R 上N 糖链中B l ，6G I e N A c 分支比M o c k 细胞增多，丽G n T V 。A S
5、H 7 7 2 l 细稳棚反。随着E G F R 上N 糖链的变化，装配体结合与自身酪氨酸磷酸忧识糟应改交，G n T V S H 7 7 2 1 细胞对E G F 亲和力和自身酪氨酸磷酸化增强，丽G n + F V A S H 7 7 2 1 - N胞这两方面能力都减弱。由此可见不同G n T - Ve D N A 转染后引起的D N A 合成和细胞增赋速度的变化的琢因之一很可能是E G F R 糖链结构和功能的改变，而E G F R 糖链B 1 ，6G 1 c N A c 分支增加有利于和E G F 的结合及随之引起的酪氨酸磷酸化，而E G F R 糖链1 3 1 ，6G l c N A
6、c 分支减少则不利于上述过程。第：部分G n T - v 对1 1 7 7 2 1 细胞中E G F 受体信号转导分子磷酸化 及活力的影晌E G F R 的结构与功能被转染的正义或反义G n T ，Vc D N A 改变后，可能会进一步引起下游信号分子磷酸化或活力的改变。E G F R 的信号通路主要有两条，一是R a s r a f - M E K + M A P K 经蒸途径，努条是新发现的P I 。3 K P K B 途径。本部分对G n T V S H 7 7 2 1 和G n T v A S H 7 7 2 1 细胞这两条通路中一些关键信号分子的磷酸化及或活力变化进行了研究。用特异性
7、抗体结合W e s t e r nb l o t 结果发现，正义或反义G n T - Vc D N A的转染并不弓 超P K B 、p 4 4 1 4 2 M A P K 和M E K 蛋自质表达的变化，而G n T V S I - 1 7 7 2 1细胞P K BT 3 0 8 、S 4 7 3 位点磷酸化和免疫沉淀P K B 豹酪氨酸磷羧化良及隘G S K 3o 【磷酸化为指标的P K B 的活性都较M o c k 细胞增加，G n T V - A S H 7 7 2 1 细嫩中这些指标的变化则相反。G n T V S H 7 7 2 1 细胞p 4 2 4 4M A P K 的磷酸化也较
8、M o c k 细胞增强，丽G n T V A S H 7 7 2 1 细胞剡减弱，表明E G F R 的这两条信号通路中信号分子的磷酸化或活力郯受G n T - V 的影响。为了研究这两条信号遥路中信号分子磷酸纯或活力改变与E G F 的关系，我们用E G F 短时间刺激血清饥饿的细胞，结果发现，当细胞血清饥饿1 2 小时后，P K B 活力和p 4 2 4 4M A P K 磷酸化明显减少至无法检测出，但M E K磷酸化仍露测懑。E ( 3 F 刻激后不嗣转染细魏中的P K B 活性、p 4 2 4 4M A P K 和M E K磷酸化都明显增加，其中G n T V S H 7 7 2 1
9、 细胞P K B 比活性、p 4 2 4 4M A P K 霹M E K磷酸化程度较M o c k 细胞增加明显，而G n T V A S H 7 7 2 1 细胞中上述捐标的增加程度则不及M o c k 细胞。为了研究P K B 活性、p 4 2 4 4M A P K 磷酸化与N 一糖链的关系，我们用N 糖链合成揶制剃衣霉素处理细胞压，发瑰不同转染细魏中P K B 活性和p 4 2 4 4M A P K 磷酸化都普遍降低，而且它们在不同转染细胞间的差别减小；衣霉素处理鳃胞后再用E G F 刺激细胞，不同转染细胞的P K B 活性都略为增高，但不及未用衣霉素处理者明显，鼠在不同转染细貔之闻的P
10、 K B 活性差别几乎消失。由此可见，P K B 的基础活性积p 4 2 4 4M A P K 的基础磷酸化及外源性E G F 刺激细胞后所引越的P K B 灞性诱导性升高也与N 一糖链有关。为了研究P K B 活性和p 4 2 4 4M A P K 磷酸化与E G F R的关系，采用E G F R 抗体处理缁胞后。发现不同转染细胞中P K B 活性和p 4 2 4 4M A P K磷酸化的差别也减小，表明嚣G F R 的N 糖链参与了其下游的信号转导。本部分扶五三反两个方向均证实出正义或反义G n T V 的转染引起的E G F RN 糖键结构改变对E G F的信号转导起重要的调节作用。2第
11、三部分G n T V 对整联蛋白表达、糖链结构的影响 及其与P K B 磷酸亿的关系整联蛋白是细胞膜上另一个与P K B 磷酸化( S 4 7 3 ) 有关的受体。用流式细胞仪法检测细胞表面燕联蛋自甄基毡6 、c t 5 和B l 的表达变化，发现转染正义G I a T - Ve D N A后，d 5 亚基在缨艟上的表达较M o c k 皇匿胞增加倍左右，僵B l 亚基豹表达没有改交，o 【6 亚基表达也明显增加。转染反义G n T Ve D N A 质c z 5 和8 l 的表达都见明照降低，0 【6 皿基表达没有明显变化。这些结果表明G n T - V 可能影响H 7 7 2 1 整联碾白
12、驻基6 、G c 5 帮p l 的基因表达。我们也矫究了整联蛋自伐5 和p l 亚基的糖链结构变化，发现不同转染细飚c c 5 弧基N - 糖链上都检测不到多天线结构，只有两天线糖链，焉B l 甄基上则既有两天线N 糖链，又有多天线N 糖链。转染正义G n T Ve D N A 后，细胞B l亚纂上多天线N - 糖链增加，两天线结构减少，而转染反义G n T - Ve D N A 后，B l 亚蒸N 糖链的变化相反，嚣天线增加藤多天线减少。F n 处理不弼转染细胞后，P K B $ 4 7 3的棚对磷酸化程度( p S 4 7 3 P K B ) 增加，其中G n T V S H 7 7 2
13、l 细胞增自较M o c k 细庭 为弱，而G n A S H 7 7 2 1 细胞增加较M o c k 细胞明显。这可能由于G n T V S H 7 7 2 1细胞对F n 的精附能力降低，而G n T V A S H 7 7 2 1 细胞对F n 的粘附能力增加所致( 本室以往结果) 。说明反义G n T Ve D N A 转染缨胞8 1 豫基上转糖链l ，6 分支结构减少，有利于F n 与c 】【5 1 3 1 结合，以致其下游效应增强。本部分结果表明G n T V 对整联蛋白的表达和糖链结构以及o t 5 f 3 1 介导的P K B $ 4 7 3 磷酸化有重要的调控作用。第暇部分
14、G r i T - V 对其他糠链结构及糠基转移酶表达的影响细胞膝上唾液酸化L e w i sX 抗原( S L C ) 是与肿瘤转移相关的糖链结构。为了研究G n T - Vg l 起的细胞转移港力的增离与S L e x 表达豹关系，本文以抗体结台流式细胞仪方法检测细胞表面S L C 抗原表达发现，转染征义G n T - Ve D N A 后H 7 7 2 1 细胞表颟S L e 。的表达量降低，荷转染反义G n T Ve D N A 后细胞表面S L e 。的表达量增高。本室已往发现H 7 7 2 1 细J j f 圣G n T V 表达量与它们豹转移潜力壁正相荚，说明G n T - V
15、引起的转移潜力升高与S L C 无关。为研究G n T - V 弓I 起H 7 7 2 1 细胞S h 。表达变他的酶学基础，以R T P C R 方法检测与S L e 。合成有关的三类糖基转移酶的表达。结果发现，转染正义G n 丁一Ve D N A 霜。不论C 2 G n T - I 、C 2 0 r I T n 还是al ，3 F u e T ，V I I 的表达量都明显降低：雨转染反义G n T - Ve D N A 后，这四种糖纂转移酶表达都增加。这可能G n T V S H 7 7 2 1 细胞上S L e x 减少而O n T V - A S I - 1 7 7 2 1 细胞上S
16、L e “ 增加的重要原因。对唾液酸转移酶( s T ) 检测发现，在G n T v S H 7 7 2 1 和G n T V A S H 7 7 2 1 细胞中，S T 3 G a l I 、I I 、I l I 乘】S T 6 G a l I 这四种唾液酸转移酶的表达都几乎没有变化，曦一例外的是S T 3 G a l I V ，它在G n T V ，S H 7 7 2 1 细胞中表达增高，而在G n T V - A S H 7 7 2 l 细胞中降低。对S T 3 G a l 和S T 6 G a l 的产物以W e s t e r nb l o t 和H R P 凝集素检测，结果表明：不同转染细胞中，糖蛋白塘链的末端S A 的a 2 ，6 连接键均多于。【2 ，3 连接键：G n T V S H 7 7 2 1 细胞中S A 的0 【2 ，3 连接键明显增加
