《T2毒素抗独特型多抗的制备及无毒ELISA定量检测试剂盒的初步研制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《T2毒素抗独特型多抗的制备及无毒ELISA定量检测试剂盒的初步研制（74页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、郑州人学2 0 0 6 届硕士学位论文中文摘要T 2 毒素抗独特型多抗的制备及无毒E L I s A 定量检测试剂盒的初步研制硕士研究生郑佳导师李文杰计融郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室郑州4 5 0 0 5 2中文摘要背景：T - 2 毒素属于单端孢霉烯族化合物中的A 族，是该类化合物中毒性最强、污染水平较高的毒素之一，主要是由三线镰刀菌，梨孢镰刀菌，拟枝孢镰刀荫和木贼镰刀菌等霉菌产生。T _ 2 毒素主要污染小麦、玉米、大麦、燕麦和黑麦等谷物及麦芽、啤酒和而包等农产品。关于T _ 2 毒素污染情况的报道，大多集中于对谷物和饲料的调查。据文献报道，T 2 毒素在各洲的谷物中广泛存在
2、。国内报道在大骨节病区小麦、玉米及非病区小麦、大米中均有检出。结合国外资料，认为T - 2 毒素在全世界不同地区，对不同谷物均有一定程度的污染。在动物实验中，2 毒素对动物显示了比较明确的免疫毒性及血液毒性，可抑制D N A 、R N A 及蛋白质合成，诱导细胞凋亡，引起白细胞缺乏等。人类误食了大量污染该类毒素的谷物后，除表现呕吐、腹痛、腹泻等急性症状外，可有白细胞缺乏，坏死性咽峡炎，骨髓发育不良，食管和胃严重坏死等，病死率高( 死亡率高达5 0 - 6 0 ) 。二战期间前_ 西伯利亚阿穆尔地区，数千人因进食了被镰刀菌污染的越冬小麦而发生食物中毒，在后来的产毒试验中，发现了高水平的T - 2
3、毒素：我国的安徽、河南两省在1 9 9 1 年因洪涝灾害而引起霉变小麦中毒，当时在采集的4 8 份样品中，4 7 份均检出T - 2 毒素，平均含量在2 5 5 9 6 7 1 6 p p b 之间，最高值可达1 0 6 4 6 p p b 。此外，T _ 2 毒素还与我国某些地区食管癌、克山病和大骨节病的高发病率有着密切的关系。近几十年，T _ 2 毒素还被作为生物战剂用于战争中。目前，检测粮谷类食品和饲料巾T 2 毒素的方法主要有薄层色谱法( T L c ) 、液相色谱法( L c ) 、气相色谱法( G c ) 、气质联用( G c M S ) 、酶联免疫吸附测郑州大学2 0 0 6 届
4、硕士学位论文中文摘要定法( E L I s A ) 等。T L c 法用目测半定量，灵敏度不高，也不适用于检测大量样品的实际需要，也缺乏选择性和敏感性，近年来应用较少。L c 、G c 足定量的检测方法，结果准确刈靠，但缺点是检出限较高，而且所用仪器设备较为昂贵。E L I s A 法是种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大样品的快速筛选，我国1 9 9 2 年申报的国标G B T 5 0 0 9 1 1 8 2 0 0 3 规定的方法为E L I s A 检测法。但是，在E L I s A 法检测过程中存在r 一问题，就是必须接触大量高浓度的T 2毒素标准品，检测人员长期接触具有潜在的
5、危险性。除此以外，T _ 2 毒素标准品价格昂贵，检测成本较高。而一种新型的免疫试剂抗独特型抗体，因其在空问构象上与T _ 2 毒素抗原存在着所谓“内影象”关系，所以有望作为T - 2 毒素的替代品用于免疫学检测，从而实现T _ 2 毒素的无毒检测，并降低成本。目的：通过制备T - 2 毒素抗独特型抗体，替代免疫检测中毒素标准品，从而建立无毒E L I S A 检测体系，用于我国粮谷中的T _ 2 毒素的检测。方法：l 采用杂交瘤技术建立分泌抗T - 2 毒素的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，采用小鼠体内诱生单克隆抗体的方法生产单克隆抗体，用酶联免疫吸附法进行单克隆抗体特性鉴定。2 采用无花果蛋白酶
6、酶切法大量制备单克隆抗体F ( a b ) 2 片段，使用快速蛋白纯化仪( F P L c ) 进行分离纯化，用酶联免疫吸附法进行F ( a b ) 2 片段特性鉴定。3 利用片段或片段联接物免疫家兔，制备T _ 2 毒素抗独特型多克隆抗体，用酶联免疫吸附法进行多克隆抗体特性鉴定。4 利用所生产的抗独特型多克隆抗体制备无毒E L I s A 定量测定试剂盒，并对其相关技术参数进行初步研究。结果：l 采用杂交瘤细胞克隆法建立了一株分泌抗T - 2 毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株( 命名为T 4 F 2 ) 。2 抗体特性经鉴定，抗体亚类为I g G l 型为主，兼有I g G 2 a 、I g G
7、 3 ；抗体腹水效价为1 ：3 _ 2 1 0 6 ；分子量为1 5 0 K D ：参考r 丁作浓度为l ：l 1 0 5 ；纯化后抗体1 2 G含量为6 5 m 咖I ，共3 6 0 m g ；抗体与其它结构类似物无交叉反应( 交叉反应率2 1 。选择对照孔阳性值较高，而且竞争抑制较为明显的单克隆细胞孔的细胞再进行亚克隆。2 2 4 杂交瘤细胞的克隆化采用有限稀释法日】，将阳性克隆细胞吹下，放于提前加入R P M I l 6 4 0 完全培养液( 含2 0 小牛血清和2 H T ) 的培养瓶中，取出1 0 “J 置计数板上，在倒置显微镜下准确计数细胞个数，根据计数结果，取大约1 0 0 个细
8、胞置于l O m l 培养液中( 培养液置于灭菌的平皿中) ，接种于加有B A L B c 小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的9 6 孔细胞培养板中，置5 c 0 2 、3 7 0 c 孵箱中培养，当镜检杂交瘤克隆生长达l 3 1 ，4 视野时，即可取上清再次筛选。阳性单克隆孔再做克隆，直至连续三次所有检测孔均为阳性时为止，即连续三次亚克隆均为1 0 0 阳性，即可将细胞转于培养瓶并扩大培养，足够数量时即可将杂交瘤细胞株冻存于液氮罐中( 1 0 7 个细胞冻存管) 或注射入小鼠腹腔生产腹水。2 2 5 单克隆抗体的生产采用动物体内诱生单克隆抗体的方法。吹打培养的杂交瘤细胞，1 0 0 0 m离心1 0
9、 m i n ，弃上清，用生理盐水将杂交瘤细胞混匀，并将细胞数调至2 1 0 6 m I ，每只B A L B c 小鼠腹腔注射o 5 m I 杂交瘤细胞，并同时于对侧腹腔注射o 5 m l石蜡油和不完全福氏佐剂混合物，l 肛1 4 d 后收集腹水。2 2 6 单克隆抗体的纯化采用饱和硫酸铵盐析法对小鼠腹水进行纯化【，对文献报道方法略有改进。取腹水2 0 m l ，加2 0 m lP B s ( 即稀释l 倍) ，加2 倍体积( 即8 0 m 1 ) 的O 0 6 m o l lp H 4 O郑州大学2 6 届硕士学位论文第一部分的醋酸缓冲液，室温搅拌2 m i n ，3 7 水浴调垒2 2
10、2 5 ( 室温2 5 左右叫不必调) 。加正辛酸1 m 1 ( 终浓度为1 6 5 呦，边搅边逐滴加入，结束时p H 值为4 5 5 5( p H 不到4 5 时，片j1 MN a O H 调至4 。5 ) ，室温搅拌3 0 m i n ，然后5 0 0 0 r p m ，1 5 ，离心1 5 m 弧将上清液过滤，装入透析袋中，于O O l m o l lp H7 2 的P B S 中透析，4 透析过夜( 间隔4 小时换一次透析液) ；终止透析后，按2 5 8 l O O m l 力硫酸铵粉末2 7 9 9 ( 共1 0 8 m 1 ) ，边加边搅拌溶解，用氨水调p H 到7 4 ，搅拌3
11、0 m n ，放4 ，2 0 h ；之后1 0 0 0 0 r p m ，4 离心1 5 m i n ；沉淀用3 0 m l P B S 溶解( P B s 用量为总量的1 2 l 3 ) ，加2 4 5 r n J 饱和硫酸铵( 终浓度为4 5 ) 洗1 2 次，1 0 0 0 0 r p m ，4 离心1 5 m i n ；再用P B s 溶解沉淀，放入透析袋，用0 。0 1 m 0 1 lp H7 ，2 的P B s 透析；终止透析后将上清分装冻存备用。2 3 单克隆抗体特性鉴定2 3 J 抗体的免疫球蛋白亚类的鉴定采用间接非竞争酶联免疫吸附法【”1 。先用包被缓冲液稀释抗亚类特异性抗体
12、，至l p g ，m 】，加至9 6 孔聚苯乙烯微孔板( E L I s A 反应板) ，1 0 钸l ，孔，4 过夜；弃去包被的抗体波，用P B s J 洗涤3 3 m i n 后，加入2 0 0 叫封闭液，3 7 封闭2 h ；弃去封闭液，用P B s H 电涤3 3 m j n 后，加入l O O l 受检抗体，放于3 7 恒温孵箱中1 5 h ；弃去抗体，用P B s T 洗涤3 次，每次3 m i n 加入1 0 0 u l 酶标二抗，3 7 ，5 0 m i n ；弃去酶标二抗，用P B s T 洗4 5 次，加入底物溶液显色，l s m i n 后用2 m o l ，I 硫酸终止
13、反应，用酶标仪在4 5 0 n m 处测定吸光度值，根据吸光度值大小判断抗体亚类。2 3 2 抗体纯度及分子量测定采用s D S 一聚丙烯酰胺凝胶电泳法( s D s P A G E ) ，具体方法参阅文献f J I 1 “。首先在电泳槽中灌入1 2 的分离胶和5 的浓缩胶，当浓缩胶聚合时，取纯化腹水2 0 叫，加等量2 上样缓冲液与M a r k e r 一起1 0 0 水浴煮沸3 m i n ；每孔上样1 5 乩插电源，调节电压为8 0 V ，溴酚蓝到达分离胶后电压可调至l v ，随后调至1 2 0 V ，直至溴酚蓝染料前沿到达凝胶末端l c m 处，停止电泳，卸下凝胶，用考马斯亮蓝R 2
14、 5 0 染色2 h ，用甲醇一乙酸水( 4 5 ：I O ：4 5 ) 混合液脱色过夜。根据样品条带判断抗俸纯度，根据标准蛋自分子量的迁移距离，绘制分子量( 对数) 相对迁移率标准曲线，建立回归方程，根据重链和轻链的相对迁移率，计算相对应的分子量。2 3 ，3 抗体的I g G 含量郑州人学2 0 0 6 届硕士学位论文第一部分采用羊抗鼠f g G 蛋白定量试剂盒测定，用包被缓冲液将羊抗鼠I g G 稀释至1 5 g m ，包被E L I s A 板，将鼠l g G 标准溶液用抗体稀释液为以下几个浓度：1 0 0 0 0 0 、5 0 0 0 0 、2 0 0 0 0 、1 0 0 0 0
15、、5 0 0 0 、2 0 0 0 、1 0 0 0 、5 0 0 、2 0 0 、1 0 0 、5 0 、2 0 、1 0 、5 、2 、I n g m I ；分别吸取不同浓度的标准溶液和纯化后腹水样品( 适当稀释)1 0 0 I 至E L I s A 反应板中，放于3 7 恒温孵箱中1 5 h ；弃去抗体，用P B s T 洗涤3 3 m n ，加入1 0 0 l 酶标抗体，3 7 5 0 m i n ；弃去酶标二抗，用P B s T 洗涤4 5 次，加入底物溶液显色，1 5 m i n 后用2 m o l L 硫酸终止反应，用酶标仪于4 5 0 n m处测定吸光度值，根据吸光度值绘制吸光
16、度值一鼠I g G 浓度( 对数) 标准曲线，建立回归方程，根据腹水的吸光度值，即可得到抗体的I g G 蛋白含量。2 3 4 抗体滴度以T 2 - B s A 为包被抗原，将抗体从】：l o o O 开始进行倍比稀释，以s P 2 ，o 细胞上清液为阴性对照，用间接非竞争E L I s A 法测定抗体滴度。以( 测定孔o D值一空白值) ( 阴性对照o D 值空白值) 三2 1 的最大稀释倍数为滴定终点。2 3 5 抗体亲和力的测定取四种倍比稀释度的T 2 - B S A ( 1 ，O 5 ，0 2 5 ，O J2 5 p g m 1 ) 包被E L I s A 反应板，加入经过系列稀释的已知浓度的纯化腹水，采用间接非竞争E L I s A 法，测定亲和力常数。以A 值对纯化腹水浓度的对数值绘制4 条标准曲线
