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1、郑重声明本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，本人愿意承担由此而产生的法律责任和法律后果，特此郑重声明。学位论文作者( 签名) ：，z ，方年y 月日I l 岛国中文摘要目的通过栓线法制备大鼠局灶性脑缺血的模型，观察大鼠脑组织显微结构的变化，检测脑组织超氧化物歧化酶( S O D ) 的活性、脑含水量、血清丙二醛( M D A ) 和一氧化氮( N O ) 的含量等，探讨芪黄汤防治大鼠局灶性脑梗塞的作用机制。方法选用W i s t a r 大鼠5 0 只，雌雄各半，适应性饲养l 周后，随机分为五组，即正常对照组、模型组、芪
2、黄汤大剂量组、芪黄汤中剂量组和芪黄汤小剂量组，每组1 0 只。采用芪黄汤( 黄芪与大黄按2 ：1 配制) 事先灌胃一周，再对模型组和芪黄汤组大鼠用2 的戊巴比妥钠( 4 0 m g k g ) 腹腔麻醉，仰卧位固定，切开颈正中皮肤及浅筋膜，钝性分离右侧胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，显露颈总动脉与迷走神经，在颈总动脉深面穿线备用。结扎颈外动脉，微动脉夹夹闭颈内动脉，在近颈总动脉分叉约3 m m 处剪一小口，用制备好的栓线插入颈总动脉并收紧活线结，松开微动脉夹，将插线推送入颈内动脉内。当遇到阻力时，说明插线已达大脑中动脉的起始处，停止插线，插入深度从颈总动脉分叉处计，一般在1 8 5 O 5 m m 。
3、扎紧颈总动脉活线结，固定插线血管外的部分，缝合浅筋膜和皮肤。等动物苏醒后出现明显偏瘫症状，身体倾斜，爬行旋转。6 小时后，断头处死大鼠，取血制备成血清，用可见光分光光度计检测其丙二醛( M D A ) 和一氧化氮( N O )的含量；取部分脑组织用干、湿重对照检测其脑含水量：制作l 的脑组织匀浆检测其超氧化物歧化酶( S O D ) 的含量；取视交叉至脚间窝冠状面制作石蜡切片，用光学显微镜观察组织细胞和神经元形态学改变。结果1 光镜显示，正常组大鼠脑组织内神经元轮廓清晰，多呈锥形、星形、梭形。细胞周围有狭带状亮区，细胞核大而圆，着色较深，位于细胞中央，偶见嗜酸性核仁。模型组，水肿主要发生在梗塞
4、区的皮质层，神经元轮廓模糊，细胞周围间隙明显增大，血管周围间隙明显增宽，胞体着色变浅，胞核浓缩，甚至核溶解，胞质分界不清，可见明显的软化灶，及粒细胞的浸润。芪黄汤组与模型组比较有明显的好转，且这种变化与药物剂量呈正相关。芪黄汤大剂量组与正常组无明显差异，表现为神经元细胞形态规则，细胞核大深染，细胞间排列较整齐，界限较清楚。中剂量组细胞形态规则，排列整齐，界限清晰，细胞间隙增宽，胞核有浓缩。小剂量组细胞松散，分界不清，细胞周围间隙明显增宽，细胞核浓缩，甚至核溶解。芪黄汤小剂量组与正常组有明显差异，与大、中剂量组有显著性差异。2 模型组动物的脑含水量、M D A 和N O 的含量均高于正常组，具有
5、非常显著的差异( p R 蒸水3 0 m l ，充分溶解，用黑纸避光保存。( 6 ) 试剂六：粉剂1 支，用时加双蒸水1 2 m l ，避光冷藏保存。( 7 ) 试剂七：液体1 2 m l l 瓶，室温保存。( 8 ) 显色剂的配制：试剂五：试剂六：试剂七= 2 5 ：1 ：1 。避光保存。( 9 ) 1 0 m m o l L 标准品3 m lX1 支，- - 2 0 “ C 以下保存。用时加双蒸水稀释成1 0 0 um o l L 标准应用液。2 6 1 操作方法( 见表4 ) ：表4N O 的测定操作法充分混匀3 0 秒，室温静置4 0 分钟，3 5 0 0 4 0 0 0 转分，离心1
6、 0 分钟，取上清。混匀，室温放置1 0 分钟，于5 5 0 h m 处，O 5 c m 光径比色杯，蒸馏水调零，比色，记录结果。2 7 石蜡切片的制作步骤( 1 ) 固定：取脑组织视交叉至脚间窝冠状面于甲醛固定液中1 2 2 4小时。( 2 ) 冲洗：将脑组织反复用自来水冲洗，最后用蒸馏水彻底冲洗干净。( 3 ) 脱水：经l O 1 0 0 酒精，逐步脱净水分。一般每步经历1 2 小时，愈往上时间愈长，至1 0 0 酒精，重复换1 次，以保证完全脱水。( 4 ) 透化：用2 5 、5 0 、7 0 、9 0 二甲苯一无水酒精透化( 如组织脱水不净，进入此步，将出现浑浊) ，每隔2 3 小时更
7、换1 次，至纯二甲苯，重复换1 次，使酒精完全脱除。( 5 ) 浸蜡：将管( 连同组织及二甲苯) 放入6 0 。C 温箱中，取熔点5 2 5 6 。C 的纯净石蜡小块片( 或熔融的石蜡) 逐步加入管中，使熔蜡达到饱和，并让二甲苯徐徐挥散，换蜡3 4 次。( 6 ) 包埋：将熔蜡及组织趁热倒入预制小纸盒中，调整组织位置，使之疏散均匀，让蜡渐渐冷凝，移浮于水面，至完全凝固。( 7 ) 切片：切取组织蜡块，于旋转切片机上切成连续蜡带4 8 “m厚。( 8 ) 粘片：被片上涂一薄层粘贴剂，加1 滴水，切取蜡带，烘干。( 9 ) 脱蜡：玻片置二甲苯中脱蜡。( 1 0 ) 染色：用苏木素一伊红( H E
8、) 染色。2 7 1 石蜡切片的H E 染色方法( 1 ) 石蜡切片置于A F ( 无水酒精和甲醛各半) 固定3 0 秒。( 2 ) 自来水洗1 分钟，H a r r i s 苏木素溶液染细胞核1 分钟。( 3 ) 自来水洗2 分钟，1 盐酸酒精分化后，流水冲洗。( 4 ) l 氨水返蓝后，流水冲洗。( 5 ) 1 伊红染液染1 5 秒，流水冲洗。( 6 ) 梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。2 8 统计学处理数据用均数标准差( ；S ) 表示，两组间比较用t 检验，多组间比较用方差分析。p O 0 5 无显著性差异。结果1 脑含水量及脑组织S O D 活性的测定：表5 芪黄汤对局灶性脑
9、梗塞大鼠脑含水量及S O D 活性的影响( ；s )注：与正常组比较# p 0 0 1 ；与模型组比较+ p 0 0 1 汤大、中剂量组比较A p 0 0 5 。芪黄汤小剂量与芪黄模型组大鼠脑含水量与正常组相比明显增加，有非常显著性差异( p O 0 1 ) ；模型组大鼠脑组织S O D 的活性与正常组相比明显降低，有非常显著性差异( p O 0 1 ) 。芪黄汤组可使脑含水量降低，增加S O D的活性。芪黄汤组均与模型组比较有非常显著性差异( p 0 0 1 ) 。芪黄汤小剂量与芪黄汤大、中剂量组有显著性差异( p O 0 5 ) 。2 血清中M D A 和N O 含量的测定表6 芪黄汤对局
10、灶性脑梗塞大鼠血清M D A 和N O 含量影响( ；S )芪黄汤小剂量组1 05 4 6 - 1 “ 1 5 7 ”1 1 9 4 3 2 4 3 6 吣注：与正常组比较# p 0 0 1 ；与模型组比较+ p 0 0 1 ；芪黄汤小剂量与芪黄 汤大、中剂量组比较A p 0 0 5 。模型组大鼠M D A 与正常组相比明显增加，有非常显著性差异( p O 0 1 ) ：模型组大鼠N O 与正常组相比明显增加，有非常显著性差异( p 0 0 1 ) 。芪黄汤组的M D A 和N O 与模型组比较有非常显著性差异( p O 0 1 ) 。芪黄汤小剂量与芪黄汤大、中剂量组有显著性差异( p O 0
11、 5 ) 。3 光镜下观察脑组织细胞形态学变化( 图1 一1 0 )正常大鼠脑组织内神经元轮廓清晰，多呈锥形、星形、梭形。细胞周围有狭带状亮区，细胞核大而圆，着色较深，位于细胞中央，偶见嗜酸性核仁。模型组，动物的脑组织可见水肿现象。水肿主要发生在梗塞区的皮质层，神经元轮廓模糊，细胞周围间隙明显增大，血管周围间隙明显增宽，胞体着色变浅，胞核浓缩，甚至核溶解，胞质分界不清，可见明显的软化灶，及粒细胞的浸润。芪黄汤大剂量组与正常组无明显差异，表现为神经元细胞形态规则，细胞核大深染，细胞间排列较整齐，界限较清楚。中剂量组细胞形态规则，排列整齐，界限清晰，细胞间隙增宽，胞核有浓缩。小剂量组细胞松散，分界
12、不清，细胞周围间隙明显增宽，细胞核浓缩，甚至核溶解。芪黄汤小剂量组与正常组有明显差异。芪黄汤组与模型组比较有明显的好转，且这种变化与药物剂量呈正相关。图l 正常组( x 2 0 0 )图2 正常组( x 4 0 0 )正常组细胞密集，排列整齐，界限清晰，细胞核大而圆，位于细胞中央。图3 模型组( x 2 0 0 )图4 模型组( x 4 0 0 )模型组细胞松散，分界不清，细胞周围问隙明显增宽，细胞核浓缩，甚至核溶解。可见软化灶。图5 大剂量组( X 2 0 0 )大剂量组细胞形态规则，圈6 大剂量组( X 4 0 0 )捧列整齐，界限清晰，核大。图7 中剂量组( x 2 0 0 )中剂量组细
13、胞形态规则，捧列整齐，图8 中剂量组( 4 0 0 )界限清晰。细胞间隙增宽，胞援有浓缩。图9 小剂量组( x 2 0 0 )图1 0小剂量组( x 4 0 0 )小剂量组细胞松散，分界不清，细胞周围问隙明显增宽细胞核浓缩，甚至核溶解。讨论1 中医理论依据1 1 病因病机特点历代医家对中风病因病机的认识很多，唐宋以前多以“内虚邪中”立论，唐宋以后多以“内风”立论，详察中风病因病机，归纳起来不外虚、火、风、痰、气、血六端。l 临床常用清热通腑、平肝潜阳、解毒通络、活血化淤、化痰通络等治法，虽取得了一些疗效，但仍然不能令人满意。因此深入开展中风病因病机研究，探索相应的防治方法，已成为提高中风临床疗
14、效的关键。我们在分析气血与脑关系的基础上，结合中医病因病机理论和临床实践及现代医学发病机制，认为“气虚血瘀”是中风病的主要病机特点。内经认为气血是脑生长发育的物质基础。气虚，是气的推动、温煦、防御和气化功能减退。“气为血之帅”，气盛则血行滑疾，气虚则无力推动血液运行，而致血液迟缓，运行涩滞，脉络瘀痹，形成瘀血。气虚直接可导致血瘀。气虚为本，血瘀为标。气虚直接或间接导致瘀血凝滞脑脉，阻塞神明之窍，清窍被蒙，神机失用。气滞又进一步加重血瘀，瘀久更虚，血瘀日久，必然影响气、血、津、精之化生，造成气血愈虚，阴精亏虚及津液生成不足。虚为本。缺血性中风气虚主要是指心气虚、脾气虚、肾气虚三方面。对虚的定位，
15、历来亦各有侧重。如果心气不足，血流缓慢，则形成血液不畅或血脉空虚，甚至气血瘀滞，凝涩而瘀，引发中风；脾胃气虚，中土阳气不运，湿聚痰生，气血不能四达，四肢经络凝涩不畅，或郁而化热，热极生风；肾气虚则元气不足，脑髓失养。五脏失去元气的推动，必致气虚无力行血而致瘀。王清任提出“亏损元气，是其本源”。元气根于肾，依。肾中精气化生，通过三焦流布于全身，温煦激发各脏腑经络的生理活动，是人体最基本最重要的气，是生命的原动力。增龄致衰，内伤疾损，所伤败者，无不为人身之气，而真元一衰，根基孱弱，则五脏皆失资助而内溃，功能紊乱，内邪横生，诸病始蕴。瘀血闭阻脑窍，局部气机停滞，脑髓失养，即可发为中风。内经有论E l
16、 - “阳气者，大怒则形气绝，而血菀于上，使人薄厥”，论及了血液停滞于脑窍发为中风。医方类聚中指出：“夫中风者，皆因阴阳不调气血错乱致于经道或虚或寒”，略有气血乱行，血瘀阻络之意。朱丹溪倡导“痰湿致中”之论的同时，对瘀血的因素有一定的认识：“半身不遂，大率多痰，在左属死血瘀血，在右属痰”。王清任论“半身不遂”病机属气虚血瘀：“元气既虚，必不能达于血管，血管必停留为瘀”。一方面，瘀血阻滞，气血津液不得畅行而外渗，稀者为饮，浊者为痰，形成脑水肿；另一方面，瘀血阻滞，郁而化痰、生火，出现气机升降逆乱，产生风的症状。气虚与血瘀交互影响，形成恶性循环。1 2 提出治疗的核心环节一益气活血，化瘀通腑。针对“气虚血瘀”这一病机特点，本方采取“益气活血，化瘀通腑”之法。较早提出运用活血化瘀法治疗中风病的为朱丹溪，此后王清任力倡活血化瘀法。不少学者认为，血瘀是缺血性中风的基本病
