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1、 I 上上 海海 海海 洋洋 大大 学学 硕 士 学 位 论 文硕 士 学 位 论 文 题题 目：目： 有机磷降解酶基因（有机磷降解酶基因（opdA）在大）在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中肠杆菌与枯草芽孢杆菌中的的表达表达与酶学与酶学研究研究 英文题目：英文题目： Preliminary studies on expression of Organic phosphorus degradation enzyme gene (opdA) in Escherichia coli and Bacillus subtilis 专专 业：业： 生物化学与分子生物学 研究方向：研究方向： 酶工程 姓姓 名：名：
2、 陈大超 指导教师：指导教师： 唐雪明 研究员 二二0一三年一三年 月月 日日学校代码: 10264 研究生学号：研究生学号： M080109242 上海海洋大学硕士学位论文 II 上海海洋大学学位论文原创性声明上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海海洋大学学位论文
3、版权使用授权书上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在 年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 上海海洋大学硕士学位论文 III 上海海洋大学上海海洋大学硕士学位论文硕士学位论文 答辩委员会成员名单答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称
4、备注 答辩地点 上海市农业科学院 答辩日期 上海海洋大学硕士学位论文 IV 有机磷降解酶基因（opdA）在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中的表达与酶学性质的研究 摘 要 有机磷农药(organophosphates, OPs)具有杀虫效率高、防治范围广、成本低等特点，在保护农作物免受病虫害侵染、提高粮食产量等方面发挥了巨大作用。但它们对人类的生存环境造成了严重的污染，并导致瓜果与蔬菜等农产品农药残留超标，直接危害人类与动物的健康。所以有机磷农药降解方面的研究在环境保护和食品安全方面受到了高度关注。 研究发现，一些能降解有机磷农药的降解菌的降解作用是通过产生有机磷降解酶来实现的。而直接使用此类有机磷降解
5、酶降解有机磷农药的效率远高于使用产生此类酶的降解菌。 来源于土壤杆菌属Agrobacterium radiobacter P230的有机磷降解酶（OpdA）具有底物范围广和催化效率高的特点，因此被公认为是迄今为止最具有应用前景的有机磷降解酶。有机磷降解酶通过水解有机磷农药的磷脂键，最终实现有机磷农药的无毒化。本研究旨在利用已有的研究基础，建立有机磷降解酶基因（opdA）大肠杆菌表达系统，实现其高效表达；同时对枯草芽孢杆菌的电转化条件进行优化，建立高效的电转化方法，并构建有机磷降解酶基因（opdA）在枯草芽孢杆菌中的分泌表达系统，克服重组蛋白在大肠杆菌表达系统以包涵体的形式在胞质中形成造成重组蛋
6、白复性困难这一难题。 1. 有机磷降解酶基因（opdA）在大肠杆菌中的高效表达与酶学研究 使用限制性内切酶Xho I和BamHI双酶切目的片段与表达质粒，将扩增的opdA基因定向插入到原核表达载体pET-28b中，构建大肠杆菌表达载体pET-28b-opdA，并将其转化到E. coli BL21(DE3)中获得重组工程菌株，经IPTG诱导实现高效表达，并对重组菌株的诱导表达条件进行优化，实验结果是：诱导前菌液OD600 的吸光值为0.5时，经1.25 mmol/L IPTG在37下诱导表达5h，重组蛋白表达量最大。重组蛋白OpdA对甲基对硫磷的Km值为42.6 mol/L，其Vmax为32.6
7、69 mol/Lmin。比酶活为24.48U/mg。 2. 枯草芽孢杆菌电转化条件的优化研究 将穿梭质粒pHY300PLK 电转化至枯草芽孢杆菌，对电转化条件GM培养基、EM培养基、RM培养基、电击时电场强度、质粒浓度进行优化。实验结果是：在GM-2培养基 （LB+0.5 M sorbitol） 、 EM-6培养基 （0.5 M sorbitol+0.5 M mannitol+10% 上海海洋大学硕士学位论文 V Glycero） 、RM-6（LB+0.5 M sorbitol+0.38 M mannitol） 、电击电压为2.0KV、质粒浓度为100 ng/l条件下，电转化率最高，枯草芽孢杆
8、菌电转化率为1.45x103个/g DNA。 3. 有机磷降解酶基因（opdA）在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达与酶学研究 利用人工合成方法的获得 opdA 基因，构建表达载体 pHT43-opdA,并将其转化至枯草芽孢杆菌 WB800N 中获得重组工程菌株。 实验结果是： 诱导前菌液 OD600 的吸光值达到 0.7 时，经 1.25 mmol/L 的 IPTG 在 37下诱导 27h，实现高效分泌表达。蛋白酶活力检测结果是有机磷降解酶 OpdA 酶活力为 1.921U/ml，比酶活为107.94U/mg。有机磷降解酶 OpdA 对甲基对硫磷的 Km值为 44.2 mol/L，其 Vmax为
9、268.39 mol/Lmin，kcat为 648.29min-1。分泌表达的酶蛋白比之前报道的酶活力提高了 0.9 倍，实现了有机磷降解酶基因（opdA）的高效分泌表达。 关键词 有机磷降解酶；大肠杆菌；基因工程；蛋白表达；蛋白纯化；枯草芽孢杆菌；分泌表达；电转化；酶学性质 上海海洋大学硕士学位论文 VI Studies on expression of organic phosphorus degradation enzyme gene (opdA) in Escherichia coli and Bacillus subtilis Abstract Organphosphorus (OP
10、s) insecticides were usually used as insecticides throughout the world and had made a significant contribution to agriculture for its advantages of high efficiency, wide range of prevention and control and low cost. However, Ops did a lot of harm to mammals and human health and pollution for environ
11、mentOps led to excessive pesticide residues of vegetables and fruits and other agricultural products. The research of the degradation of organophosphorus pesticide had been paid more attention by researchers. It is an effective method to take advantage of microbial probiotics and digestion enzymes t
12、o degrade chemical pesticides for soil and water Some esearchers showed that some microbial probiotics could efficiently degrade organophosphorus pesticide by organophosphate digestion enzymes reaction. And it is an effective method to directly take advantage of digestion enzymes than using of micro
13、bial probiotics. The gene of opdA was isolated from Agrobacterium radiobacter P230. OpdA is the most application organophosphate degradation enzymes for its high substrate range and catalytic efficiency. OpdA is effective on hydrolyzation of various OPs. In this study, we described the cloning and e
14、xpression of plasmid pET-28b-opdA in Escherichia coli (E. coli), and experimental programs were carried out to obtain an optimal transformation efficiency of Bacillus subtilis electroporation experimental program and optimization conditions for electroporation of Bacillus subtilis cells.Then we cons
15、tructed secretion expression system in Bacillus subtilis of opdA to overcome the difficulties of the recombinant proteins expression in Escherichia coli system in the form of inclusion body. 1. Studies on expression of organic phosphorus degradation enzyme gene (opdA) in Escherichia coli. Using rest
16、riction enzymes Xho I and BamHI for double enzyme digestion of opdA and vector pET-28b, we inserted opdA gene into vector pET-28b to construct a recombination plasmid pET-28b-opdA, which was subsequently transformed into BL21(DE3), producing engineering strain BL21(DE3)/pET-28b-opdA. The OD600 was 上海海洋大学硕士学位论文 VII 0.5, after induction with 1.25mmol/L IPTG at 37 for 5h, the Km of OpdA for parathion-meth
