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1、堕塑堕圭兰垡墼_ ! 堡坚三壁翌! ! ! 生盛塑塑苎墨堂壅至自：! 垄苎塑型! ! ! 至量! 塑! 望堕! 塑堡旦1 7 肛- 雌二醇对E T - 1 生成的调控及微囊蛋白1在其抑制E T - 1 诱导V S M C 增殖中的作用博士研究生：谈智导师：王庭槐教授专业：心血管生理中山大学中山医学院生理学教研室摘要内皮素1 ( e n d o t h e l i n - 1 ，E T - 1 ) 最初于1 9 8 8 年由日本学者Y a n a g i s a w a 首先从猪的主动脉内皮细胞培养液中分离纯化的生物活性多肽，由2 1 个氨基酸残基组成，是迄今所知体内最强烈持久的血管收缩因子。随
2、后的研究表明，在生物体内主要存在四种内皮素亚型。其中E T - 1 是内皮素在生物体内的个主要亚型，主要由血管内皮细胞合成，具有强大的促血管平滑肌细胞( v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s ，V S M C ) 增殖、收缩血管和升高血压等作用，与心血管功能关系密切。近来研究表明，除血管内皮细胞外，V S M C 也能合成和分泌E T - 1 ，在调节心血管功能方面具有重要作用。由于E T - 1 是体内主要分布于心血管系统的内皮素亚型，具有强大的缩血管、促增殖作用。因此调节体内E T - 1 的生成，对于心血管疾病的发生发展具有十分重要
3、的作用。E T - 1 首先是从内皮素前体原m R N A ( p r e p r o E T - I m R N A ) 合成有2 1 2 个氨基酸残基的内皮素一1 前体原( p p E T - 1 ) 开始的，p p E T - 1 在一种能特异性识别碱性氨基酸对的内肽酶作用下，水解释放出内皮素前体( h i 西T - 1 ) 。b i g E T - 1 由3 8 个氨基酸残基组成，在生物体内活性极低，在内皮素转化酶( e n d o t h e l i nc o n v e r t i n g e n z y m e ，E C E ) 作用下，水解1 t p 2 1 V a l 2 2
4、 间的肽键，释放出具有生物学活性，由2 1 个氨基酸残基组成的内皮素1 。目前已知三种内皮素转化酶的存在：E C E - 1 、E C E - 2 和E C E - 3 ，它们分别由不同的基因编码，结构上具有同源性。虽然E C E 具有三种不同的异构体，但根据E C E 在体内组织中分布，以及发挥作用的最佳p H 值来看，E C E 一1 是机体内将b i ：庐T - I 转化为E T - 1 的主要内皮素转化酶亚型。许多心血管疾病，如高血压、动脉粥样硬化和血管损伤反应过程中，E T - 1 都参与其中。研究表明，在动脉粥样硬化的发展演变过程中，E T - 1 起着重要的作用。在动脉谈智博士学
5、位论文：1 7 口一雌二醇对E T - 1 生成的调控及微囊蛋白1 在其抑制E T - 1 诱导V S M C 增殖中的作用粥样硬化斑块中发现E T - 1 m R N A 和E T - 1 的水平增高，血浆中E T - I 水平的增高与动脉粥样硬化的程度呈正相关。同时也有证据表明，E C E 1 在这些心血管疾病的表达也增加。在未损伤的大鼠颈总动脉上，E C E 一1 只在内皮细胞上表达；使用球囊损伤血管内皮细胞后，在新增生的血管内膜V S M C 上出现大量E C E 1 的表达。虽然人类的动脉粥样硬化不同于血管球囊损伤模型，但它们有一个共同的病理过程，即新生内膜V S M C的大量增生。
6、在人动脉粥样硬化斑块V S M C 中，也发现有大量E C E 一1 的表达增加。E C E 1 和E T - 1 在心血管疾病中共存的现象提示在这些病理过程中，E C E 1 表达增高导致E T - 1 生成的增加，对心血管疾病的发生发展有着十分重要的作用。而在这些病理状态下，内皮细胞受到损伤，V S M C 生成的E T - 1 是体内增高的内皮素的主要来源。大量的临床流行病学资料和动物实验结果都表明雌激素具有明显的心血管保护作用。但雌激素心血管保护作用的机制尚未完全阐明。过去的研究大多集中于雌激素对脂质代谢的影响，但研究结果并不能完全解释雌激素的心血管保护效应。究其原因，发现雌激素的心血
7、管保护作用只有大约l 3 来自调节脂质代谢，另外2 3 则来自于雌激素对血管壁的直接作用等，主要是对血管内皮细胞( E c ) 和血管平滑肌细胞( V S M C )的作用。血管壁上雌激素受体的发现，为雌激素对血管壁的直接作用提供了物质基础。我们前期的实验证明，雌激素通过其受体的作用抑制生长因子如E T - 1 诱导V S M C 增殖来发挥其血管保护作用。但也有报道表明雌激素替代疗法并不能减少心血管病的发生，如美国国立卫生研究院宣布中止激素替代疗法，但各家对此看法不一。该实验结果究竟是雌激素作用所致还是孕激素的作用所致目前尚有较大的争议，也存在有孕激素剂量过大或雌激素剂量过大的可能。同时，大
8、量实验证明，雌激素确实具有降低血脂，保护内皮，抑制V S M C增殖迁移和血小板粘附聚集等血管保护作用。在动物模型上，研究表明与同期雄性或去势雌性猴子相比，雌激素可以减少5 0 心血管疾病的发生率；雌激素还可以抑制实验性动脉粥样硬化的发展。所有的这些都提示雌激素具有血管保护作用，但其具体机制还未阐明，因此有必要进一步加深对雌激素作用机理的研究。近来研究表明，雌激素可以调节E T - 1 的生成：男性血浆中的E T - 1 的浓度比同年龄女性高，同时在月经周期中E T - 1 的浓度随着雌激素水平变化而改变。雌激素替代疗法可以降低E T - 1 的浓度，而对照组中E T - I m R N A
9、水平增高、E T - 1 浓度增加。然而雌激素调控E T - I 生成的机制目前尚未明了。在E T - 1 生物合成过程中，无活性的b i g E T - 1转化为具有高活性的E T - I 是其发挥生物学效应的关键性一步，而E C E 1 则在其中发2一鲨翌堕主兰垡笙苎! ! ! Q ：些三壁型兰! ! 生些塑塑塑丛塑塞墨皂：! 垄茎塑型星! ! 重量! ! 坚兰塑堕主堕堡里挥重要的作用。在E C E - 1 的作用下，能将无活性的b i g E T - 1 ( 3 8 肽) ，水解T r D 孔一V a l 2 2间的肽键，释放出具有生物学活性E T - 1 ( 2 1 肽) 。目前有关雌
10、激素对E C E l 的调节还未见相关报道，因此本研究在探讨雌激素调控E T - 1 生成的机制中，重点观察雌激素对E C E 1 的作用及其机制。近年来，许多研究表明细胞质膜微囊和它上面标志性的结构蛋白微囊蛋白I 对许多关键信号分子的活性状态起着直接的调节作用，在心血管系统中发挥着重要的作用。细胞质膜微囊是首先由P a l a d e 等人使用电子显微镜，在毛细血管内皮细胞上观察到的细胞表面质膜向内凹陷所形成的特异性囊泡样结构，直径约5 0 1 0 0 n m 。最初细胞质膜微囊主要的功能被认为是在内皮细胞和上皮细胞中通过摄粒作用参与某些大小分子的跨膜物质转运。近年来随着细胞质膜微囊的标志性
11、蛋白微囊蛋白1 的发现，细胞质膜微囊越来越多的功能被揭示出来。微囊蛋白1 是相对分子质量为2I 24 K D 的完整膜蛋白，由N 末端区、跨膜区和c 末端区组成，其N 末端和C 末端均面向胞浆面，高度富集于细胞质膜微囊中，它是细胞质膜微囊的标志性蛋白，在维持其形态、结构、功能中起重要作用。微囊蛋白一l 作为细胞膜上信号传导系统的组装平台和绞手架分子，位于各种刺激因素进入细胞内的起始环节，起着调节细胞信号传导的“开关”作用。许多在信号转导中起着关键性作用的信号分子如G 蛋白偶联受体( 包括E T R ) 、G 蛋白c 【亚单位、非受体酪氨酸激酶，内皮一氧化氦合酶( e N O S ) ，蛋白激酶
12、C 、E R K l 2激酶通路与雌激素受体( E R ) 等都与微囊蛋白一1 相互作用。这种细胞质膜微囊上各种信号分子通过微囊蛋白一1 的“格室化”分布，提示细胞质膜微囊和微囊蛋白一l 在调节细胞信号转导过程具有重要作用。大量研究证实，V S M C 的迁移，过度增殖以及由此引起的大量的细胞外基质合成是导致动脉粥样硬化、高血压和经皮腔内冠状动脉成形术后管腔狭窄等多种心血管疾病的形成过程中的关键环节。E T - 1 在这个环节中起了重要的中介作用。我们已经证实了雌激素可以抑制E T - 1 诱导的V S M C 的增殖，但其机制尚未完全阐明。我们的实验表明雌激素可以下调V S M C 上内皮素
13、A 型受体( e n d o t h e l i n Ar e c e p t o r ，E T A R ) 的表达来抑制E T - 1 诱导的V S M C 的增殖。E T R 属于G 蛋白偶联受体，主要位于细胞质膜微囊上，与微囊蛋白一1 相连。而研究已表明细胞质膜微囊上有雌激素受体的存在，与微囊蛋白一1 相连，且雌激素可以调节微囊蛋白l 的表达。因此提示我们雌激素可能通过调节微囊蛋白一1 来抑制E T - 1 诱导的V S M C 的增殖。有关E T - 1 与其受体结合后刺激V S M C 增殖的信号转导途径已研究不少，但从微囊蛋白一1 水平研究其在E T - 1漩智博士学位论文：1 7
14、 1 3 - 雌二醇对E T - 1 生成的调控及微囊蛋白1 在其抑制E T - I 诱导V S M C 增殖中的作用刺激V S M C 增殖中的作用还未见报道。我们业已证明了1 7 B 雌二醇可以调节V S M C上E T A R 的表达。那么微囊蛋白一1 在E T - 1 通过E T A R 发挥其生物学活性时，发生了什么改变，在1 7 3 雌二醇抑制E T - 1 诱导的V S M C 的增殖扮演什么角色? 因此，本研究还重点探讨微囊蛋白1 在1 7 B 一雌二醇抑制E T - I 诱导V S M C 增殖中的变化。为进一步明确雌激素血管保护作用提供新的作用位点，同时有助于阐明微囊蛋白一
15、1 在V S M C 中的生理功能。综上所述，本研究重点利用去势动物模型及培养的V S M C ，采用免疫印迹( W e s t e r nb l o t ) 和逆转录聚合酶链反应( R T - P C R ) 等技术，从整体、细胞和分子水平三个层面探讨1 7 1 3 雌二醇在调控E T - I 作用的起始环节，包括对E T - 1 生成的调节，微囊蛋白一1在E T - 1 诱导V S M C 增殖中的作用，以及雌激素调节微囊蛋白一l 来抑制E T - 1 诱导的V S M C 增殖中的作用，将有助于进一步加深对雌激素血管保护作用机制的了解，同时也能加深对E T - 1 信号途径和微囊蛋白一1
16、 在血管生物学中作用的了解，这对于动脉粥样硬化等心血管疾病的防治具有积极意义。论文主要包括以下三个部分：第一部分1 7 B 雌二醇对去势雌性大鼠E T - I 生成的影响及其机制1 1E 2 对去势雌性大鼠血浆E T - 1 浓度的影响1 2E 2 对去势雌性大鼠m 管p r e p r o - E T - 1m R N A 表达的影响1 3E 2 对去势雌性大鼠血浆E T - 1 清除率的影响1 4E 2 对去势雌性大鼠血管功能性E C E 活性的影响1 5E 2 对去势雌性大鼠血管E C E - 1m R N A 表达的影响第二部分1 7 B 雌二醇对培养大鼠V S M CE T - 1 生成的影响及其机制2 1E 2 对基础状态下和A n g l I 诱导状态下V S M CE T - 1 生成的影响2 2E 2 对基础状态下和A n g l I 诱导状态下V S M CE C E - 1 活性的影响2 3E 2 对基础状态下和A n g l I 诱导状态下V S M Cp r e p r
