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1、金雀异黄素对金鱼消化酶活性和抗氧化系统的影响摘要金雀异黄素是富含于豆科植物中的一种异黄酮，结构与哺乳动物雌激素类似，是大豆及其制品中含量最高、活性最强的一种植物雌激素。一方面，金雀异黄素通过各种途径富集于水体，使鱼类暴露其中；另一方面，以植物蛋白为主要原料的饵料也含有大量的金雀异黄素，造成鱼类面临水体和食料的双重污染。目前，有关金雀异黄素对鱼类影响的研究仍然较少。初步研究认为，金雀异黄素可从多个方面干扰鱼类的生长、生殖和正常行为。但现有结果还存在许多分歧，不能充分说明金雀异黄素对鱼类生长发育、生殖遗传及行为等的影响模式和作用机理，值得从多个层次进行广泛而深入的研究。本文选用金雀异黄素作为实验药
2、品，以个体较小，实验室易饲养的金鱼为实验动物，通过腹腔注射的方式，分别将金鱼以O 2 、2 和2 0 p g 的金雀异黄素处理7 天。检测了金雀异黄素对金鱼卵黄原蛋白的诱导和血清性激素水平的影响，以证明金雀异黄素作为一种弱雌激素对金鱼产生的雌激素效应。另外，在渔业生产和鱼类养殖中，金雀异黄素对鱼类正常生长和营养价值的影响也受到关注，所以本文对金鱼消化酶、抗氧化酶活性进行了测定，为了解金雀异黄素对鱼类生理生化状况的影响提供基础资料和参考。研究结果表明：( 1 ) 0 2 、2 和2 0 心g 金雀异黄素腹腔注射处理金鱼7 天，将各处理组血清进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳( N a t i v e P
3、 A G E ) ，经糖蛋白、磷蛋白和脂蛋白染色后，确定了金雀异黄素对雄性金鱼V T G 的诱导作用，并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( S D S P A G E ) 检测发现该V T G 具有2 个蛋白亚基，分子量分别为1 3 0 k D a 和8 3 k D a 。另外，经放射性免疫分析发现，处理组雄性金鱼血清睾酮含量下降，雌二醇含量上升，而且以2 p g 组变化最为明显，进步证明了金雀异黄素对金鱼的雌激素效应。( 2 ) 金雀异黄素处理7 天，各浓度处理组金鱼肝脏和肠道蛋白酶和淀粉酶活力均比对照组下降，其中2 p g 组显著下降( P 金雀异黄素( g e n i S t e i l l
4、) 雌马酚( e q u 0 1 ) 大豆黄素( d a j d z e i n ) 鹰嘴豆芽素A ( b i o C b a n i n A ) 。而在鲟鱼中，金雀异黄素 花柄芒素 雌马酚 大豆黄素 鹰嘴豆芽素A 。未成熟鲟鱼的活体实验清楚的证实了口服2 0 p p m 金雀异黄素可诱导V T G 产生( L a t o n n e l l ee ta 1 ，2 0 0 2 ) ，而在未成熟虹鳟鱼体内进行的相同的实验只有1 0 0 p p m 才能明显加强G 的合成( B e 彻e t a u P e l i s s e r oe ta 1 ，2 0 0 1 ) ，植物雌激素的雌激素活性在虹
5、鳟鱼中是E 2 的1 l o o o l 2 0 0 0 ( P e l i s s e r oe ta 1 ，1 9 9 3 ) ，而在鲟鱼中是1 4 0 0 1 1 0 0 0 0 ( L a t o 加e l l ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。这些数据表明，鲟鱼对金雀异黄素的敏感性与虹鳟鱼是不同的。实验方法的不同也会产生不同的结果，已有报道指出体内和体外实验的结果存在差异。W 1 1 i t t e n 等指出用纯化的蛋白质实验时，异黄酮表现出与E R 有高亲和力，而在整个细胞或细胞溶质制备品中竞争力减弱( W h i t l e I l & N 硪o l i l l ，1 9
6、 9 8 ) 。除了以上因素，E R 戗和E R p 数量和分布的差异也是重要因素之一，因为植物雌激素会优先选择与E R p 结合( W h i t t e n &N a R o l i n ，19 9 8 ；K u i p e re ta 1 ，19 9 7 ) 。1 4 2 抑制内源类固醇代谢Y u l i a n a ( Y u l i a n ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 等发现大豆中的金雀异黄素等异黄酮类植物雌激素对E 2 代谢具有影响。研究者用不同浓度的金雀异黄素、大豆黄素、6 甲氧大豆素及三种物质的混合物分别处理虹鳟鱼( 锄咖船c 甜s 驯触) 、大西洋鲑1 6金雀异黄素
7、对金鱼消化酶活性和抗氧化系统的影响( 勋砌Ds 口娴和湖红点鲑( 鼢如P 砌甜s 挖a m 缈c 琳协的肝脏及。肾脏组织，结果发现1 州和1 0 州的金雀异黄素能够抑制虹鳟鱼、大西洋鲑肝脏和。肾脏中及湖红点鲑肝脏中E 2 的代谢，l “M 的大豆黄素、6 甲氧大豆素和三种物质的混合物( 1 “M金雀异黄素，0 8 州大豆黄素，O 2 肛M6 甲氧大豆素) 均会抑制虹鳟鱼体内雌激素的代谢。有报道指出在湖红点鲑、虹鳟鱼中发现了I I 期类固醇代谢酶磺基转移酶( S U L T ) 和葡萄糖醛酸转移酶G D ，而这些酶可将葡糖醛酸和硫酸酯结合到E 2等内源性类固醇的羟基上，使其水溶性增强，促进其代谢
8、。异黄酮类物质含有两个或三个羟基，可竞争性抑制E 2 与这些酶的结合，影响其代谢( Y u l i a I l ae ta 1 ，2 0 0 6 ) 。K a u s K k 等( K a u s h i ke ta 1 ，1 9 9 5 ) 在虹鳟鱼胆汁中检测到金雀异黄素和大豆黄素的葡萄糖醛酸结合物，证明了异黄酮类物质可以作为这些酶的底物从而影响E 2 等内固醇的正常代谢。虽然异黄酮抑制E 2 代谢的具体机制还不清楚，但结果说明了异黄酮在鱼中发挥其雌激素效应的机制至少部分是通过抑制外周靶组织中E 2 的代谢从而提高它的生物利用率来实现的，这也解释了为什么在异黄酮与E R 结合力较弱的组织中也
9、能发挥其雌激素作用。1 4 3 酶调节植物雌激素在硬骨鱼中与E R 结合力相对较弱，所以，植物雌激素发挥其雌激素效应可能还通过其它的途径。各种酶类在鱼类的各项生命活动中发挥着重要的作用，一些研究证据表明雌激素化合物发挥作用的另一条途径可能是通过调节鱼体酶活性，包括E 2 代谢酶，芳香酶，细胞色素P 4 5 0 。，前列腺素H 合酶，蛋白激酶C ，酪氨酸激酶和D N A 修饰酶等( Z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。用8 0 谷甾醇和较少比例的菜油甾醇、谷甾烷醇、菜油甾烷醇等混合物暴露斑鳟时发现，U D P 葡萄糖醛酸转移酶( U D P G T ) 活性受到了抑制( L
10、e h t i n e ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。O r l a l l d o 等( O r l a l l d oe ta 1 ，2 0 0 2 ) 报道暴露于纸浆厂流出物的鱼脑中和卵巢中芳香酶活性增加。金雀异黄素对金鱼消化酶活性和抗氧化系统的影响1 5 研究展望目前，植物雌激素对鱼类的影响已引起广泛观注，国内外学者也逐渐开展了相关研究，但就现在的研究结果来看，还有很多分歧，甚至还出现研究结果相反的现象，而且有关植物雌激素对鱼类影响的作用机制的研究还相对较少。今后这些都将继续成为研究的热点。由于植物雌激素对鱼类影响的研究数据尚不够充分，也有研究发现使用一定量的植物雌激素添加剂
11、不但不会对鱼类生长带来负面影响，反而可能会有促进作用，所以目前还难以对植物蛋白代替鱼粉作为新型饵料的利弊进行评判，因此，有必要进行更完善和深入的研究，了解不同鱼类在不同生理阶段适宜的植物雌激素用量，同时还需深入研究植物雌激素类物质在鱼体中的残留及其对人类健康的影响，这不但对于开发新型鱼饲料，发展水产养殖业具有重要意义，而且对人类，在理论和应用上均有重大的意义。金雀异黄素对金鱼消化酶活性和抗氧化系统的影响2 金雀异黄素对金鱼V T G 的诱导和性激素的影响卵黄原蛋白( V i t e l l o g e n i n ，V T G ) 是一种高分子量的含糖、含磷、含脂的蛋白，在内源性雌激素或外源性
12、雌激素作用下，由卵生动物肝细胞产生，经血液运输到卵巢，经过修饰后以卵黄蛋白形式储存于卵母细胞。V T G 作为卵黄蛋白的前体，最主要的功能是形成卵黄，为胚胎发育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、硫和磷等营养和功能性物质，同时V T G 还在生物体内承担着多种生物学功能，包括作为生物体内大分子物质载体和金属离子转运载体的功能、免疫防御功能等( 洪文杰，2 0 0 7 ) 。当然最重要的是其作为检测化合物雌激素效应生物标志物的功能。因为V T G 一般只在成熟雌鱼体内合成，而在幼鱼或成年雄鱼体内含量极低，难以检测出，但在外源性雌激素的作用下幼鱼及成年雄鱼体内也能诱导V T G 基因的表达及其蛋
13、白的合成( K o r t ee ta 1 ，2 0 0 0 ；F u n k e n s t e i ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。根据这一特性检测幼鱼或雄鱼体内V T G 删 矾A 水平及V T G 含量可用以评价化学物的雌激素样作用，目前已发展成为最常用的生物指标( S u m p t e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。鱼类性类固醇激素，如睾酮、1 7 p 雌二醇等是体内胆固醇的衍生物，生理作用主要有三个方面：第一是刺激性腺的发生和发育，包括生殖导管的发生、维持，以及配子的发生；第二是引起第二性征和性行为的发生，当配子发育到准备受精阶段，性类固醇激索诱导两性聚集在一起
14、，以保证受精顺利进行，第三是对垂体促性腺激素的反馈作用，以维持性类固醇激素的正常生理作用( 林浩然，1 9 9 9 ) 。因此，鱼体血清性激素含量可作为化学物质对鱼类繁殖功能损伤的敏感指标，用于评价物质的环境内分泌干扰效应。金雀异黄素与天然雌激素1 7 B 雌二醇结构相似，可以与体内的雌激素受体( E R ) 结合，而发挥雌激素作用。但与内源性雌激素相比，金雀异黄素的雌激素效力较弱，仅相当于雌二醇的l 1 0 5 。1 1 0 3 ( S a l o I l i e m i c & W a h a l a ，1 9 9 5 ) 。经研究表明，金雀异黄素可诱导雄性虹鳟鱼、青鳟、钝吻鲟、幼年条纹狼
15、鲈等鱼类产生可检测水平的V T G ( Y u l i a n ae ta 1 ，2 0 0 6 ；B e 皿e t a u P e l i s s e r oe ta 1 ，2 0 0 1 ；Z h a J l ge ta 1 ，2 0 0 2 ) ，植物雌激素还能够影响动物体内多种性激素( 尤其是睾酮和雌二醇)的水平( L e h t i n e ne ta 1 ，1 9 9 9 ；B e n n e t a u P e l i s s e r oe ta 1 ，2 0 0 1 ；Z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。1 9金雀异黄素对金鱼消化酶活性和抗氧化系统的影响本章
16、节应用常规和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，对金雀异黄素诱导雄性金鱼产生的V T G 进行了检验和分子量的测定；利用放射性免性分析方法，检测了金雀异黄素处理后雄性金鱼血清睾酮、雌二醇含量的变化，以期通过这些试验了解金雀异黄素对金鱼的雌激素效应。2 1 材料和方法2 1 1 试验动物试验用金鱼g o l d f i S h ( 跏口，s f 淞口甜阳f 嬲) 购自青岛市南山市场，在中国海洋大学生态毒理实验室驯养2 周后进行试验。金鱼平均体长( 8 9 7 士0 4 1 ) c m ，平均体重( 2 4 5 4 士3 4 1 ) g 。试验动物的饲养与管理：试验过程中采用5 0L 水族箱( 试验前用高锰酸钾进行消毒处理) ，每个水族箱加入连续曝气2 4h 的自来水，投鱼1 0 尾。每天换水1 3 ，水温保持在( 2 0 士2 ) ，溶解氧为( 7 Q 士0 1 ) m g L ，p H ( 7 6 士O 2 ) ，光暗比为1
