《微囊化猪虹膜色素上皮细胞纹状体移植治疗帕金森病大鼠的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微囊化猪虹膜色素上皮细胞纹状体移植治疗帕金森病大鼠的实验研究（99页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、复卫土学博士碍竟生丰土论文霸词P DI P E各固K6 一O H D AS N cA P OT HD AH V AN G FB D N FG D N FR T - P C RH R PH P L C本文常用的缩略词P a r k i n s o n sd i s e a s ei r i sp i g m e n te p i t h e l i a la l g i n a t e - p o l y l y s i n e a l g i n a t e6 - h y d r o x yd o p a m i n es u b s t a n t i an i g r a lp a r s
2、c o m p a c t aa p o m o r p h i n et y r o s i n eh y d r o x y l a s ed o p a m i n eh o m o v a n i l l i ca c i dn e r v eg r o w t hf a c t o rb r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o rg l i a lc e l ll i n e d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o rr e v e r s et r a n s c
3、 r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y帕金森病虹膜色素上皮海藻酸钠多聚赖氨酸一海藻酸钠6 羟基多巴胺黑质致密部阿朴吗啡酪氨酸羟化酶多巴胺高香草酸神经生长因子脑源性神经营养因子胶质源性神经营养因子逆转录多聚酶链反应辣根过氧化物酶高效液相色谱论文独创性声明本论文是我个人在尊师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论
4、文中除了特；! j 加以标注和致谢的地方外，不包含其它人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其它同志列本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：论文使用授权声明本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定。即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的沦文在解密后遵守咄规定。作者签名：一咩师签名：一一一曙期复卫土学博士碍宪生牛土论文十文稿姜微囊化猪虹膜色素上皮细胞纹状体移植治疗帕金森病大鼠的实验研究中文摘要帕金森病( P a r k i n s o n Sd i s
5、 e a s e ，P D ) 是以黑质多巴胺神经元变性为特征的疾病，细胞移植是有前景的治疗方法。寻找合适的供体细胞是P D 细胞移植的关键问题之一。虹膜色素上皮细胞( i r i sp i g m e n te p i t h e l i u m , I P E ) 在解剖结构上和睫状体上皮细胞等相连，为单层上皮细胞，其下可见基底膜，可与基质分离。近年来发现体外培养的I P E 含有多种生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子，胶质源性神经生长因子，脑源性神经生长因子，色素上皮生长因子等。这些生长因子对于保护神经细胞、促进细胞的生长和发育有一定作用。虽然目前未见I P E 细胞分泌多巴胺的报道，但
6、是I P E 细胞胞浆中含有黑色素颗粒，考虑到多巴胺和黑色素的产生有着共同的通路，所以我们检测了体外培养的I P E 细胞，我们发现I P E 细胞可以分泌多巴胺和多种神经营养因子，并可以结合铁离子，所以我们认为I P E 细胞可以作为帕金森病移植治疗的细胞来源。免疫排斥是细胞移植的难题，海藻酸钠一多聚赖氨酸是一种生物相容性良好的半透膜材料，用它来包裹移植物可以很好起到免疫隔离的作用。本实验旨在：1 详细研究猪I P E 细胞体外多巴胺及神经营养因子的分泌特性。观察失去光线刺激的外环境是否会影响其功能，为其下一步的移植奠定基础。2 将该细胞用海藻酸钠一多聚赖氨酸包裹制作成微囊后，观察微囊包裹对
7、细胞活性和其分泌特性的影响。3 将微囊包裹后的I P E 细胞立体定向植入P D 大鼠模型的纹状体，观察移植后疗效。第一部分猪I P E 细胞的体外原代培养及鉴定目的：建立稳定的猪I P E 细胞原代培养、纯化及鉴定方法。方法：酶消化法获取猪I P E 细胞，纯化及传代后，观察细胞形态及生长状况；绘制细胞生长曲线；免疫细胞化学方法鉴定细胞：细胞角蛋白( c y t o k e r a t i n ) 和S 一1 0 0 的表达，统计阳性细胞数，分别计算原代和传代后阳性细胞率。结果：细胞胞浆内含有大量黑色素颗粒；细胞经纯化、传代后，c y t o k e r a t i n 和S 一1 0 0
8、表达阳性率均较原代提高，P 0 0 5 ) 。遮光组的铁结合力似乎低于其他两组，但是没有统计学意义。免疫细胞化学法检测到I P E 细胞中有T H 的表达；R T - P C R 方法检测到I P E 细胞内有T Hm R N A 的表达。第三部分海藻酸钠微囊的制作及微囊对I P E 细胞生物活性的影响目的：优化适合I P E 细胞的微囊制作条件。观察微囊化对细胞分裂以及D A 、神经营养因子分泌情况的影响。方法：应用高压静电式微囊成型装置制备海藻酸钠多聚赖氨酸微囊化细胞，摸索最适合的制备参数；显微镜下观察微囊的形态，并测量微囊的直径，用移植所用的针头来回抽吸微囊观察其强度；显微镜下观察囊内细
9、胞的生长状况，并在第0 、3 、6 、9 、1 2 天破囊后进行细胞计数并用台盼兰染色法检测囊内细胞存活率；将微囊化和非微囊化两组细胞在接种后第1 6天收集培养上清液，检测其中D A 、H V A 、B D N F 、G D N F 、N G F 以及N T - 3 的量，观察微囊包裹对其分泌特性的影响，并检测铁结合力。结果：制备微囊的最佳参数为：室温1 8 2 0 ，内层海藻酸钠浓度为2 4 ，外层海藻酸钠浓度为0 2 4 ，液面高度为2 2 2 5 m m ，成囊电压为3 2 8 k v ；微囊形态接近正圆，表面光滑，大小均一，直径为：2 7 5 t 2 3 u m 。微囊经针头抽吸后未见
10、破损；微囊内细胞的总数没有明显变化；细胞微囊化后培养6 0 h 内，微囊组的D A 分泌与非微囊组相比明显增加：6 0 h 以后，二者无显著差异。微囊内细胞H V A 、B D N F 、G D N F 、N G F 、N T - 3 的分泌量与非微囊组细胞相比无显著差异。铁结合力二组之间没有显著性差别。第四部分P D 大鼠模型的建立及I P E 细胞的移植2复卫土学博士研竟生牛土语文十文捕姜目的：建立稳定的6 - O H D A 毁损的偏侧P D 大鼠模型，确立可靠的行为学评价指标。观察微囊化I P E 细胞移植到模型大鼠纹状体的疗效。方法：1 模型的制备及鉴定：6 一O I - I D A
11、 毁损内侧前脑束( m e d i a lf o r e b r a i nb u n d l e ，M F B ) 建立P D 大鼠模型，通过旋转试验、组织病理证实，并评价其它行为学指标是否有效。2 移植分组：分为I P E 细胞+ 微囊组；空微囊组；单纯手术损伤组，进行右侧纹状体两点立体定向移植，分别植入2 x 1 0 4 个I P E 细胞、约2 8 0 个含细胞的微囊，相应的对照组注射等量的生理盐水和空微囊。3 移植后的检测：观察移植后大鼠旋转行为以及其他行为学指标的变化；H P L C 法测定各组纹状体区D A 和H V A的含量。移植后第1 2 周，取大鼠脑进行T H 的免疫组化染
12、色。提取移植区周围组织的蛋白，电泳后观察移植物是否影响移植区周围脑组织的蛋白合成。结果：1 。大鼠模型经旋转试验、组织病理鉴定模型成功。2 行为学指标：调整步态、启动时间、单足运动的步距和速度是有效的行为学指标，自由运动的步距和速度不适合作为P D 大鼠模型的行为学评价指标。3 移植后I P E + 微囊组：3 3 的大鼠( 1 0 只) 旋转行为在移植后第1 周开始逐渐改善，至第4 周改善更加明显( 与其他组相比，P 0 0 5 ) 。表2 各代R P E 细胞在第4 8 h 时上清液中多巴胺的量( u g ，1 0 4 细胞，x s ，n - 3 )传代数第1 代第2 代第3 代第4 代第
13、5 代第6 代多巴胺0 ，1 3 5 70 ，2 0 3 7土0 1 9 6 50 1 8 9 70 1 8 5 1土O 1 9 6 10 0 5 20 0 5 30 0 4 4 20 ，0 6 6 50 0 3 80 ，0 5 6 4图2 1 ：各代I P E 细胞在第4 8 h 时上清液中多巴胺量二、光照对I P E 细胞生化功能的影响光照组的D A 分泌在前1 6 小时和其他两组无差别，1 6 小时后的D A 分泌明显高于其他两组( P o 0 5 ) 。遮光组的铁结合力似乎低于其他两组，但是没有统计学意义。( 图7 、8 、9 、1 0 )复卫上学博士舛竟生毕主论文摹二螂分图2 - 2
14、 光照对I P E 细胞分泌D A 的影响图2 3 光照对I P E 细胞分泌H V A 的影响图2 4 光照对I P E 细胞分泌B D N F 的影响复王上学博士研览生牛业论文第二却分图2 5 光照对I P E 细胞分泌G D N F 的影响图2 - 6 光照对I P E 细胞分泌G D N F 的影响图2 7 光照对I P E 细胞分泌N T - 3 的影响i 王土学博士研竟生牛业论文$ ；邯分图2 8 光照对I P E 细胞铁结合力的影响2 I P E 细胞T H 免疫组化结果I P E 细胞可见部分细胞胞浆呈棕黄色，胞核周围染色最深，黑色素颗粒清晰可见，胞体向周同延伸的细长突起亦呈弱
15、阳性( 图2 9 ) 。图2 - 9 I P E 细胞T H 染色4 0 03 R T - P C R 法检测I P E 细胞有T Hm I I N A 的表达复卫土学博士碍竟生毕生论文a t ；椰分图2 1 0 ：I P E 细胞及R P E 细胞中T H m R N A 的表达讨论I P E 细胞是虹膜结构中重要的一层细胞，以前认为I P E 细胞的功能主要为遮蔽光线和调节光亮。不过近年来发现体外培养的I P E 含有多种生长因子和细胞因子，如碱性成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子，脑源性神经生长因子，色素上皮生长因子等。这些生长因子对于保护神经细胞、促进细胞的生长和发育有一定作用2 1
16、。多巴是多巴胺和黑色素的共同底物，两者的通路有一定的重合。I P E 细胞可以产生黑色素，但是没有关于其含有T H ，分泌D A 的报道。所以虽然I P E 可以分泌一些神经营养凶子，对一些变性疾病有一定作用，但是用于帕金森病的移植治疗证据不足。本部分运用细胞免疫化学法、H P L C 和R T - P C R 方法详细研究了新生猪( 出生后6 小时内) I P E 细胞体外分泌D A 特性。细胞免疫化学法发现T H染色阳性；R T - P C R 检测到T H 的m R N A ；用H P L C 电化学法检测基础状态下I P E细胞接种后第4 ，8 ，1 2 ，2 4 ，3 6 ，4 8 ，6 0 ，7 2hD A 的分泌，发现基础状态下猪I P E 细胞在接种后4 h 就可以检测到D A ，4 8 h 达高峰，以后趋于稳定并略微下降。D A 分泌时间曲线的观察对下一步移植时间的选择有重要的指导价值。研究还发现各代I P E 细胞D A 分泌无显
