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1、器材准备医学微生物学实验 综合性实验一v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（五）糖发酵试验药敏试验血浆凝固酶试验半固体接种法糖发酵试验v不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的 代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又 产气，据此，可以鉴别各种细菌。 糖发酵管：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖 。 指示剂：溴甲酚紫，PH6.8为紫色，5.2为黄色。 原理：多糖单糖丙酮酸、酸性产物(产气) pH指示剂呈酸性变色。 结果:培养基变色无气泡“+” ，培养基变色有气 泡“”，培养基不变色“-”。v应用：观察细菌对糖的分解情况，常用于肠道 杆菌的鉴定。细菌的糖发酵试验P16 甲,乙紫黑葡萄糖,乳糖 丙,丁粉
2、红葡萄糖,乳糖2-3cm37，24小时甲，乙，丙 ，丁实验分组v俩俩相对4人为一组,组号编在电源插座上。v每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为 甲、乙、丙、丁。 甲 乙4 丙 丁甲 乙3 丙 丁甲 乙2 丙 丁甲 乙1 丙 丁甲 乙5 丙 丁甲 乙8 丙 丁甲 乙7 丙 丁甲 乙6 丙 丁甲 乙10 丙 丁甲 乙9 丙 丁讲台细菌药物敏感性试验P20v磺胺1907年发现，1935年临床应用。青霉素 1929年发现，1945年临床应用。v我国住院病人抗菌素使用率达70%，新生儿病房 抗菌素使用率达100%。v为了避免抗菌药物使用的盲目性，防止因不合 理用药，导致耐药性细菌的增多、药物中毒、
3、 治疗失败、菌群失调等问题的发生，用药前（ 时），做药物敏感性试验。药物敏感性试验纸片扩散法v将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细 菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶 解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细 菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长 的抑菌圈v依抑菌圈的有无、大小来判断敏感性。敏感（Sensitive ）：试验细菌所引起的感染，可以 用常用剂量的某种抗菌药物治愈。耐药（Resistant ）：试验细菌引起的感染，不能用 该种抗菌药物治愈。 试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或 半密集为宜。实验分工（每人1块平板）v甲黄色菌液平板 +
4、 青、链、庆纸片。v乙白色菌液平板 + 青、链、庆纸片。v丙紫黑菌液平板 + 青、链、庆纸片。v丁粉红菌液平板 + 青、链、庆纸片。实验方法v接种环取菌液36ul2环（注意：操作时，不 得同时握持菌液管和平板，以免菌液倒出来， 造成污染）。平板密集划线接种细菌（纱窗样 ）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距 离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊 子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已 设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。 371824小时培养，观察结果。 试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈 密集或半密集为宜。灭菌 取样甲黄色菌液 乙白色菌液 丙紫黑菌液 丁粉红菌液6ul+6
5、ul纸片扩散法：菌液 密集涂布平板 标记:青 、链、庆 贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片 按压 倒置培养1824小时 观察结果。青链庆青链庆标记贴抗菌素纸片血浆凝固酶试验P17v致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中的纤维 蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。v葡萄球菌产生两种凝固酶:一种是与细胞壁结合的凝 固酶,为结合凝固酶;另一种是细胞释放于培养基中, 为游离凝固酶；二者抗原性不同。v在体内，凝固的血浆沉积在菌体表面，阻碍吞噬细胞 的吞噬和杀菌物质的破坏，从而有利于细菌的生长繁 殖、引起感染。v体外试验有试管法和玻片法两种。试管法检测游离凝固酶，结果准确。玻片法只能检测结合凝固
6、酶，比较简便、常作为快速筛选技 术（金黄色葡萄球菌中有10%15%可呈阴性反应）。凝固酶试验试管法： 游离凝固酶凝血酶纤维蛋白原纤维蛋白血浆凝固凝固酶试验玻片法：结合凝固酶（菌体表面） 纤维蛋白原纤维蛋白细菌凝集玻片法v取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。v分别用接种环取白色和黄色菌苔(23个菌落的 菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。v出现明显凝块为阳性，否则为阴性。白色菌苔容易混合均匀，黄色菌苔常涂抹不开 。 反复旋转或侧倾载玻片，让菌液流动起来，结 果更明显。载玻片1张兔血浆各15ul右侧血浆与白色菌苔混合左侧血浆与黄色菌苔混合半固体接种法P11v具有鞭毛能够真正运动的细菌，在半固体培基中,能
7、冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移动扩散生长，培养基呈扩散云雾状混浊状态。v无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。v方法：接种针斜面取菌，从半固体培养基中心，垂直 刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退 出接种针。 v甲，乙紫黑 。丙，丁粉红。半固体接种法P11甲，乙紫黑 丙，丁粉红 标记:组号,颜色37,24小时安全警告v本次实验（糖发酵试验、药敏试验、血浆凝固 酶试验和半固体接种）操作一次，可能产生几 百个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内 扩散开,5um通过呼吸道直接到达肺泡。vPike博士对
8、实验室感染统计分析结果发现，不 明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气 中扩散引起的。v实验时应坐着，在酒精灯半径20厘米范围内操 作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动， 以免感染病原菌。思考题v细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义? v为什么要在发酵管液面上方大约23cm处切割？v培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？v抗生素敏感性实验有何实际意义?v血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入 消毒缸内，为什么?v半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”?v为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还 设立哪些对照? v细菌的糖发酵试验P16甲紫黑葡萄糖，乙 紫黑乳糖，丙粉红葡萄糖，丁 粉红乳糖 。v细菌的药敏试验P20（菌液）甲黄色平板 + 青、链、庆纸片乙白色平板 + 青、链、庆纸片丙紫黑平板 + 青、链、庆纸片 丁粉红平板 + 青、链、庆纸片 v血浆凝固酶试验P17兔血浆15ul+黄色,白色v半固体接种法P11甲,乙紫黑 丙,丁粉红微量发酵管管口朝下， 37培养1824小时。常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘 。 试管架上器材：按接种针、接种环、油性笔和打火机的顺 序，分别放置在试管架中间两行，靠近电源插座一侧。器材使用以后，必须放回原处，依次摆整齐。实验室器材 整齐有序
