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1、 目录中文摘要OOOOOO OOO OOOOO OOO oOoO ooo ooo oooooo ooOeOO ooO OO0 l英文摘要OOOO OOOOO OOO OOO OOOOOO OQO OOOOOOOOO OO0 0 00 000000 000000 3研究论文血必净注射液对脓毒症大鼠肺损伤保护作用的研究前言”一”一”“”OOOOO O ”一“OO OOOO ”OOO OOO ”6月O 舌”“”一”“”一“”“”。材料与方法OOOOO0 6结果”“”“一”一“”一”“”OOOOO OOOO1 2附图O O OOOOOO0 1 5附表”一”2 l讨论”一”一”一”一”一”“”“”OOO
2、 OOO ”2 3结论”一”“”一”“一”“”一”OOO OOOOOO O OO ”“”一”一“2 6参考文献2 6综述血栓调节蛋白及核因子K a p p aB 与脓毒症关系的研究进展2 9致谢OOOOOO OO O OOOOOOOOO OOOOOO O OO QOOO OOOOOO OOOOOOO O 3 8个人简历3 9中文摘要血必净注射液对脓毒症大鼠急性肺损伤 保护作用的实验研究摘要目的：观察脓毒症大鼠急性肺损伤模型肺脏形态学、病理学改变及核因子k a p p aB ( N F 1 出) 的表达、血浆血栓调节蛋白( T M ) 浓度和血清肿瘤坏死因子a ( T N F a ) 浓度，并观
3、察应用血必净注射液后上述指标的变化，从蛋白C ( P C ) 途径、内皮细胞损伤、炎症因子的角度探讨脓毒症的发生机制及血必净注射液对脓毒症肺损伤的保护作用。方法：采用盲肠结扎穿孔术( C L P ) ，制备大鼠脓毒症模型。选用健康S p r a g n e D a w l e y ( S D ) 大鼠1 4 4 只，体重在2 0 0 - - - 2 3 0 9 之间，随机分为4 组：空白对照组( A 组) 2 4 只、假手术组( B 组) 2 4 只、脓毒症组( C组) 4 8 只、血必净治疗组( D 组) 4 8 只。各组动物按术后处死时间点6 、2 4 、4 8 、7 2 小时各分为4 个
4、亚组，A 组和B 组的每个亚组6 只大鼠，C组和D 组的每个亚组1 2 只。D 组分别按C L P 后0 、12 、2 4 、3 6 、4 8 、6 0小时经尾静脉注射血必净注射液4 m l k g 。C 组和B 组于相应时间点经尾静脉注射相应量生理盐水。各组大鼠自C L P 术毕开始计时，于相应时间点将动物麻醉后，经腹主动脉采血测定血浆T M 浓度、血清T N F Q 浓度，取右肺下叶行苏木精伊红( H E ) 染色观察形态学改变，免疫组化检测N F K B 的表达。结果：大鼠一般情况的观察：B 组大鼠均存活，苏醒早，一般状况逐渐好转，进食水及大便正常；剖腹未见恶臭、肠管坏死、腹腔水肿等表现
5、。C 组大鼠均有严重的脓毒症表现：苏醒延迟、逐渐出现精神萎靡、竖毛、活动减少、不再扎堆取暖，进食量减少、腹泻及呼吸频率加快等表现，2 4 小时后出现死亡；剖腹有恶臭，可见血性惨液、肠管水肿粘连、盲肠肿胀坏死。D 组大鼠与C 组相比临床表现有所减轻，死亡数有所减少。病理观察：A 组大鼠肺呈均匀粉红色；光镜下组织结构完整清晰，肺泡壁完整，肺泡腔无炎细胞浸润，偶有少许红细胞。B 组大鼠与A 组无明显差异。C 组大鼠双肺肿胀，呈暗红色，肺表面可见散在出血点及出血斑，切面含血量多，可有实变区或萎陷区；光镜下早期肺泡壁毛细血管扩张、中文摘要瘀血、炎性细胞浸润，肺水肿、弥漫肺出血及肺泡腔塌陷，部分透明膜形成
6、，后期可见肺泡塌陷明显，肺大疱形成，病变2 4 小时达顶峰，其后无减轻趋势。D 组大鼠较C 病理损伤轻且有减轻趋势。血浆T M 浓度：A组与B 组血浆T M 浓度较稳定，两者差异无统计学意义，p 0 0 5 。C 组大鼠C L P 后6 小时血浆T M 浓度开始升高，并逐渐上升，至7 2 小时仍无下降趋势，与A 、B 组比较差异有统计学意义，p O 0 5 。与A 组、B组相比，C 组在各个时间点( 6 、2 4 、4 8 、7 2 小时) 血浆T M 浓度均升高，差别有统计学意义，P 0 0 5 。与A 组及B 组相比，C 组在各个时间点( 6 、2 4 、4 8 、7 2 小时) 血清T
7、N F Q 浓度均升高，差别有统计学意义，p 0 0 5 ( 见F i g 5 A 、F i g 6 A 、F i g 7 A 、F i g 8 A ) ；C 组N F K B 阳性细胞于术后6 小时开始增多( 见F i g 5 C ) ，术后4 8 小时达高峰( 见F i g 6 C ) ，并持续到7 2 小时，明显高于A 组与B 组，p 3 8 。C 或 9 0次分；呼吸频率 2 0 次分，或动脉血二氧化碳分压，即P a C 0 2 1 2 x 1 0 札，或 l O 。凡具备上述4 种临床表现两种以上者，即可诊断为S I R S 。2 0 0 1 年1 2 月有关专家经过讨论后修正了S
8、I R S 的诊断要点【2 1 ，除了以前的指标，增加了C 反应蛋白与前降钙素的炎症指标、高排低阻的血液动力学指标。脓毒症特指具有细菌学证据S I R S ，其发病和死亡率均很高。脓毒症以及继发的多器官功能障碍综合征( m u l t i p l eo r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m e s ，M O D S ) 是导致危重患者死亡的主要原因。脓毒症的病理生理基础是全身炎症反应、微血管凝血及血管内皮细胞损伤等因素间的相互促进、相互影响。近年来的研究表明，血栓调节蛋白( t h r g m b o m o d u l i n ，T M ) 因其
9、抗凝、促进纤溶、抗炎等作用在脓毒症的发生、发展及治疗方面发挥着重要作用；核因子K a p p aB 作为炎性反应放大环路上的一种重要转录因子，在免疫应答、应激反应及细胞凋亡的调节中起主导作用，从而在脓毒症的发展中起着重要作用。lT M 与脓毒症的关系1 1T M 概述T M 又称调凝蛋白，是1 9 8 1 年首次由E s m o n 和O w e n 提出，并于次年从兔的肺组织中分离并命名的一种膜糖蛋白【3 一。1 1 1 T M 的分布T M 广泛存在于动脉、静脉、毛细血管及淋巴管的内皮内，但在各器官中的含量不均匀，以肺内含量最高，其次是胎盘【5 】。近年发现，在表层综述鳞状上皮细胞、血管平
10、滑肌细胞、培养细胞变种、内皮细胞瘤及血小板上也有低水平表达【6 】。从人类血液和尿液中还可分离出分子结构较小的可溶性T M t 7 1 。1 1 2T M 的结构及功能T M 的结构类似低密度脂蛋白受体，是一种多节段跨膜糖蛋白，T M分子量约为7 5 0 0 ，二硫键降解后的分子量为1 0 5 0 0 0 ，其表达产物由5 7 5个氨基酸构成，修饰成熟后的T M 由5 5 4 个氨基酸残基构成。这种二级结构使T M 在内环境变化时具有稳定性。T M 一般可分为5 个功能区，第一区由2 2 3 个氨基酸残基组成的N 末端即凝集素样结构区，该区不参与激活、活化P C 的过程，可以通过内吞途径调节细
11、胞表面T M 表达，同时对细胞内外凝血酶的聚合起重要的生理性调节作用【8 】。第二区由2 3 6 个氨基酸残基组成的6 个表皮生长因子( E G F ) 结构重复片段即重复E G F 结构区，其中5 、6 重复片段为凝血酶激活P C 的作用。第三区为富含丝苏氨酸区，O 糖基位点集中部位，O 糖基位点中硫酸软骨素对T M 凝血酶的结合起稳固作用。第四区为2 3 个氨基酸组成的跨膜区。第五区为3 8 个氨基酸组成的羧基末端胞浆功能区，有较多的磷酸化，这与T M 的内吞作用有关。人类T M 基因位于第2 0 号染色体上，单股m R N A 约含有3 7 7 0 0 个碱基。从人类血液和尿液中可分离出
12、的可溶性T M ，为2 - - - ，6 侧枝三线和2 4 侧枝三线的复合型寡糖【9 】。1 2T M 与脓毒症的关系1 2 1 抗凝作用T M 通过两个途径发挥抗凝作用：( 1 ) 与凝血酶结合，形成复合物，使凝血酶由促凝物转变为抗凝物；( 2 ) 加速凝血酶复合物活化蛋白C ，发挥其抗凝及促纤溶作用。P C 系统是体内天然的抗凝系统，由蛋白C ( p r o t e i nC ，P C ) 、T M 、蛋白S ( p r o t e i nS P S ) 和内皮细胞蛋白C 受体( e n d o t h e l i a lc e l lp r o t e i nCr e c e p t o
13、 r , E P C R ) 组成。P C 是由肝脏合成的维生素K 依赖性蛋白酶原，在 凝血酶和T M 的共同作用下被激活，成为有活性的活化蛋白C ( a c t i v e dp r o t e i nC ，A P C ) ，灭活V a 因子和H a 因子，从而发挥凝血作用【I o 】。凝血酶原是由肝脏合成的，以维生素K 作为辅因子的，由5 8 2 个氨基酸残基组成的酶原，被因子Xa 在A r g T h r 及A r g I l e 处切开，切除了N 端2 7 4综述个氨基酸残基，余下的3 0 8 个氨基酸残基分成A 、B 两条肽链，由一个二硫键相连，即为凝血酶( t h r o m b
14、i n ) ，参与了内源性及外源性凝血的过程，并对凝血过程起正反馈作用，同时参与血凝块的形成，在整个凝血过程中发挥着重要作用。T M 是使凝血酶由促凝物转变为抗凝物的关键物质【l l 】，虽然凝血酶是P C 的激活剂，但在体外，凝血酶激活P C 的速度很慢，在体内的反应速度可提高2 0 0 0 倍以上，首先内皮细胞表面的T M 与凝血酶以化学剂量1 ：l 的比例形成可逆性凝血酶一血栓调节蛋白( t h r o m b i n t h r o m b o m o d u l i n ，T - T M ) 复合物。该复合物中的凝血酶丧失了激活血小板、激活V 因子和因子及催化纤维蛋白原变成纤维蛋白的
15、能力【1 2 】，但却获得了比游离凝血酶强1 0 0 0 倍的活化P C 能力，而后T _ T M 复合物将P C 提呈给E P C R ，使P C 转化成A P C 。T M 发挥抗凝作用的功能部位是内皮生长因子( e n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , E G F ) 样结构域4 - 一6 ，与凝血酶组合用与P C 相互作用的位点在E G F 5 6 上。E G F 6 缺失，会使T M 对凝血酶的K m 值升高近1 0 倍，而E G F 5 缺失凝血酶就不能与T M 结合【l ”。E G F 4 不影响凝血酶与T M 反应的K m 值，但E G F 4 可加速T M 对P C 的活化。E G F 4 的两个区域对T M的辅因子活性非常必要，第一区域包括谷氨酸( G l u ) 3 5 7 ，酪氨酸( T y r )3 5 8 ，谷氨酰胺( G i n ) 3 5 9 ，与第一、二个二硫键环部分重叠：第二区域是氨基末端区第三个二硫键环，包括G l u 一3 7 4 、甘氨酸( G l y ) 3 7 5 、
