《骨髓间充质干细胞移植治疗老年性痴呆大鼠的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓间充质干细胞移植治疗老年性痴呆大鼠的实验研究（57页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、天津医科大学硕士学位论文中文捅要目的：研究B M S C s 移植对B 淀粉样蛋白诱导的老年性痴呆模型大鼠行为学的影响，并探讨其治疗A D 的可能机制，为老年性痴呆的临床治疗提供更多有价值的实验依据和方法。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离B M S C s ，B M S C s 移植前掺入1 0m g L 的B r d U 进行标记。采用向成年雄性S D 大鼠双侧海马立体定向注射A l l l 枷的方法诱导A D 动物模型，将实验动物随机分为对照组( 生理盐水组) 、模型组( 痴呆组) 与移植组，模型组、移植组左右侧海马各注射5 9 L A p l _ 4 0 ( 1 0 I t g
2、 )溶液，对照组注射等量生理盐水。移植组造模后3 周采用同样方法移植骨髓间充质干细胞，对照组及模型组大鼠不做处理。采用M o r r i s 水迷宫观察比较大鼠移植前后的行为学变化。造模后2 个月处死大鼠，以免疫组化检查( B r d u + N S E 、B r d u + G F A P 及n e s t i n 单染阳性细胞1 为客观指标，观察移植后的B M S C s 在大鼠脑内存活及分化情况。结果：1 通过密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离大鼠骨髓间充质干细胞，经流式细胞仪检测所分离出的细胞，结果显示细胞表达C D 9 0 和C D 2 9 ，符合B M S C s的形态及细胞表面标志
3、物等特性，并且可在体外进行分化、传代、扩增，具有良好的自我更新能力和多向分化潜能，证实分离所得细胞为骨髓问充质干细胞：2 采用向大鼠双侧海马立体定向注射A B l 枷的方法制作A D 动物模型，模型组大鼠逃避潜伏期( 5 7 1 2 _ 4 ：6 4 3 s ) ，较对照组( 4 1 3 5 + 6 3 4 s ) 明显延长( 尸 0 0 5 ) ，说明随时间增加A D 模型大鼠学习记忆能力没有明显好转；( 3 ) 对照组大鼠逃避潜伏期较前一次比较明显缩短，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ；( 4 ) B M S C s 移植组大鼠与模型组大鼠比较，逃避潜伏期明显缩短( 尸 0 0 5
4、 ) ，但未达到对照组水平( 尸 0 0 5 ) ，移植组大鼠逃避潜伏期较治疗前明显缩短( P 0 0 5 ) ，详见表l 。3 2 1 1 治疗前后大鼠跨越平台次数观察结果( 1 ) 造模后模型组与对照组比较，跨越平台次数减少，差异有统计学意义( P O 0 5 ) ；( 2 ) B M S C s 移植后2 周模型组大鼠跨越平台次数与前相比没有明显变化，对照组大鼠跨越平台次数与前相比明显增多，差异有统计学意义( 尸 O 0 5 ) ：( 3 ) B M S C s 移植组大鼠跨越平台次数较治疗前明显增多，治疗后移植组大鼠与模型组大鼠比较，跨越平台次数明显增多( P 0 0 5 ) ，但未达
5、到对照组水平( 尸 0 0 5 ) ，详见表2 。3 2 1 2 大鼠寻找平台的运动策略检查结果第五天最后一次训练完后撤去平台，于N E 位置入水点将大鼠面向池壁放入水中，进行空间探索实验，记录大鼠在1 2 0 s 内的运动轨迹及穿越平台的次数。寻找平台的运动策略分为：边缘式、随机式、趋向式和直线式。见图5 。结果显示模型组大鼠搜索策略以随机式和边缘式为主，移植组和对照组以趋向式和直线式为主。1 9天津医科大学硕士学位论文三、骨髓间充质干细胞治疗A D 大鼠-_-_-I_-_-_-_-_-I-_I_-_-_-_-_-_l_I_-一一一一 表lB M S C s 移植前后各组大鼠逃避潜伏期比较(
6、 鲻)另J ( n = 1 0组)造模后逃避潜伏期( s J迨堕亘些避潜垡塑垡 对照组4 1 3 5 + 6 3 42 1 5 5 + 3 3 3 a模型细5 7 1 2 + 6 4 3 *5 2 9 5 + 4 8 6 木移植组5 8 7 6 + 6 1 1 幸3 5 5 6 + 4 2 9 木- A - a事：与对照组相比P 0 0 5 ；：与模型组相比P 0 0 5 ；a 治疗前后同组比较P O 0 5 。表2B I q l S C s 移植前后各组大鼠跨越平台次数比较( 趾S )塑型( 璺三! Q !堕堡厦堕垄垩鱼达塑迨堑亘堕垫垩鱼达塑 对照组5 2 + 1 9 67 7 + 2 1
7、l模犁组1 9 + 0 7 5 *1 8 士O 9 2 奉移植组2 0 士0 8 4 *5 5 + 1 8 4 木a宰：与对照组相比P O 0 5 ；：与模型组相比P 0 0 5 ；口治疗前后同组比较P O 0 5 。直线式随机式趋向式边缘式图5大鼠探索平台运动策略轨迹图天津医科大学硕士学位论文二、骨髓间充质干细胞治疗A D 人鼠3 2 2 病理学检查结果在建立大鼠痴呆模型后2 个月处死大鼠，取三组大鼠脑组织进行病理切片观察。3 2 2 1H E 染色：本实验为异体B M S C s 移植，未使用免疫抑制剂，三组均未发现肿瘤形成及免疫排斥反应。3 2 2 2 免疫组织化学染色：本实验中在移植组
8、损伤中心( 海马移植部位) 及其周围可见B r d U + N S E 、B r d U + G F A P 免疫组织化学双染阳性细胞( 核红浆棕黄色) 。( 见图6 ) 。B r d U + N S Ex 2 0 0图6 免疫组化染色B r d U + G 巾x 2 0 03 3 讨论3 3 1 A D 发病机制及临床治疗A D 病理学特征是：与学习、记忆相关的大脑皮层中出现老年斑、神经纤维缠结及神经元的缺失 2 0 1 。目前主要的可能机制包括：( 1 ) A 1 3 的细胞毒性作用( 包括氧化应激损伤、诱导细胞凋亡和抑制胆碱能神经系统等) ( 2 ) T a u 蛋白学说( 3 )A p
9、 o E 学说( 4 ) 早老素学说( 5 ) 突触素中枢神经炎性损害( 6 ) 自由基损伤和氧化应激学说【2 1 - 3 3 1 。目前尚无特效治疗方法，主要是支持、对症治疗，在综合治疗的基础上针对主要病因进行重点治疗，采取综合性治疗策略。A D 的治疗目前仍以药物为主。目前主要广泛应用的药物包括：( 1 ) A c h E 抑制剂：A D 患者脑M a y n e r t 基底核天津医科大学硕士学位论文三、骨髓间充质干细胞治疗A D 大鼠及海马和新皮层区胆碱能神经元减少导致乙酰胆碱神经递质水平降低，从而导致认知功能及情绪行为的障碍，根据这一理论提出了用胆碱能制剂治疗。通过抑制胆碱酯酶而抑制
10、乙酰胆碱降解并提高其活性，改善神经递质的传递功能，主要包括安理申、艾斯能等。A c h E 抑制剂可改善轻中度认知障碍，此类药物只可减缓A D 进展而不能逆转疾病过程。( 2 ) N 甲基D 天冬氨酸( N M D A ) 受体拮抗剂：美金刚。N M D A 受体激活后引起的兴奋性毒性是A D 的重要发病机制之一；美会刚是一种低亲和力的非竞争性N M D A 受体拮抗剂，可通过抑制N M D A受体介导的兴奋性毒性阻止A D 的发展。临床研究发现单独应用胆碱酯酶抑制剂时疗效有限，仅对部分患者有效，而美金刚对既往曾服用过胆碱酯酶抑制剂的患者疗效显著且能降低胆碱酯酶抑制剂的不良反应，所以通常联合应
11、用这两种药物 3 4 1 。( 3 ) 其他药物：自由基清除剂和抗氧化剂、5 H T 受体拮抗药、钾通道阻滞剂、脑代谢激活剂及中药治疗等，通过减少自由基的生成和保护神经元免受自由基损害、促进脑神经细胞对氨基酸、磷脂及葡萄糖的利用等机制达到部分改善临床症状的目的。由于这些药物的治疗作用主要集中在维持退化的胆碱能神经元功能及疾病的早期，并不能真正治愈晚期A D 患者。一因此，寻找能够改善A D 患者中、晚期症状的治疗方法已迫在眉睫。2 0 世纪末人们发现成年哺乳动物脑内仍存在干细胞，通过药物或其他方法促使内源性干细胞增殖、分裂来弥补A D 脑内神经元数量减少，以最终达到减缓或阻止A D 发病进程并
12、有望逆转A D 发病。所以干细胞移植有其应用前景。3 3 2 B M S C s 治疗A DB M S C s 是一种良好的细胞替代治疗的靶细胞。体外诱导多能干细胞分化为目的细胞，进行细胞移植以修复受损的神经组织，一直是基础和临床应用研究的热点。而B M S C s 以其来源广泛、取材方便、易于体外扩增、免疫排斥反应弱等优点，已然成为细胞移植治疗老年性痴呆的新的研究热点。3 3 2 1 水迷宫测试结果分析智力减退、近期记忆障碍是A D 重要的临床症状和特征，因此对学习记忆进行评价是观察A D 动物模型及药物治疗效果的重要指标之一【3 5 1 。M o r r i s 水迷宫实验是种让实验动物学
13、习寻找水中平台的操作过程，主要应用于检测大鼠空间学习记忆功能，已经被广泛应用于研究A D 海马记忆损伤的效果和药物研究 3 6 1 。M o r r i s 水迷宫定位航行实验是将大鼠放入水中，利用啮齿类动物天性会水天津医科大学硕+ 学位论文三、骨髓间充质干细胞治疗A D 大鼠但又怕水的特性作为驱动力，迫使动物找到平台避水上岸，并通过训练，学会利用环境标记物与隐匿平台关系来判断水中平台位置，形成稳定的空间认知，动物必须通过游泳和寻找水下平台才能强化这一认知，所形成的记忆是空间参考记忆。这种空间参考记忆进入意识系统，其储存与提取涉及边缘系统( 包括海马) 、纹状体、基底前脑和其他的神经区域。啮齿
14、类动物在完成空间学习和记忆任务时，涉及了大量脑区和神经传导路型3 7 】，至少有海马、纹状体、基底前脑、小脑的参与，这些部位的任何环节损伤都会表现出水迷宫学习成绩的缺陷p 引，空间学习与水迷宫成绩都依赖于不同脑区间的相互作用，这些脑区组成了一个功能完整的神经网络。所以海马及相关部位损害，包括A D ，大鼠会出现学习记忆能力的下降；相反，若学习记忆能力提高，说明相关损伤区域有一定程度的修复。随机式策略的轨迹分布于迷宫的大部分区域，盲目性大；边缘式以自我为参照点，是一种本能行为，处于较低级的认知水平上；趋向式是一种较高级的策略，此时大鼠对目标的位置及方向判断基本正确，定位尚不够准确；直线式是大鼠根
15、据迷宫外线索逐渐形成的高级的参考认知方式，这两种搜索方式与随机式和边缘式有质的差异【3 9 】。本实验通过向大鼠双侧海马立体定向注射A B l 舶诱导A D 动物模型，造模后模型组与对照组比较，逃避潜伏期延长，跨越平台次数减少，差异有统计学意义，说明造模后大鼠学习记忆能力下降，模型制作成功。对照组大鼠与前相比，跨越平台次数增多，逃避潜伏期缩短，说明随着时间推移，训练强化，大鼠学习记忆能力提高。模型组大鼠逃避潜伏期及跨越平台次数与前相比，没有明显变化，说明随时间增加，A D 模型大鼠学习记忆能力没有明显好转。移植组大鼠与模型组大鼠比较，逃避潜伏期明显缩短，跨越平台次数明显增多。同时通过本实验观察
16、，从大鼠探索平台的策略来看，模型组大鼠采取边缘式和随机式搜索模式显著多于其他各组，移植组和对照组以趋向式和直线式为主。说明模型组大鼠空间学习记忆能力下降，骨髓间质干细胞移植组大鼠较模型组大鼠的空问学习记忆能力有明显改善。证实了B M S C s 移植能够改善A D 大鼠空间学习记忆能力。3 3 2 2 组织学观察结果分析3 3 2 2 1 H E 染色本实验为异体B M S C s 移植，未使用免疫抑制剂，三组均未发现肿瘤形成及天津医科大学硕士学位论文三、骨髓间充质干细胞治疗A D 大鼠免疫排斥反应。移植干细胞增殖的可调控性及其致瘤性也是引起广泛关注的热点问题之一。W a k a o 等f 4 0 】将B M S C s 诱导为S c h w a n n 细胞后移植入食蟹猴
