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1、http:/ 应用全血应用全血PCR直接扩增技术检测亚甲基四氢叶酸还原 酶基因直接扩增技术检测亚甲基四氢叶酸还原 酶基因C677T多态性多态性1刘冉1，尹立红1，浦跃朴1，周国华2，王仪3，潘恩春3，杨文洲3 1东南大学公共卫生学院,（210009） 2华东医学生物技术研究所,（210002） 3江苏省淮安市疾病预防控制中心,（223001） E-mail（） 摘摘 要：要：目的目的 了解淮安汉族人群亚甲基四氢叶酸还原酶基因MTHFRC677T多态性及其地理分布特征， 评价全血PCR直接扩增技术在大规模现场人群基因多态性筛检中的应用价值。 方法方法 对 205 例淮安汉族健康个体分别采用全血P
2、CR直接扩增技术和以基因组DNA为模板的传统PCR-RFLP技术分析MTHFRC677T的基因型分布频率，并与不同地区的汉族人群资料进行了比较。结果结果 全血PCR直接扩增技术和以基因组DNA为模板的传统PCR-RFLP法测定MTHFRC677T遗传多态的分布频率具有高度一致性(Kappa0.946，95%CI 0.9060.985)；传统PCR-RFLP法测定淮安汉族人群MTHFRC677T的基因型频率分别为CC 31.71%、CT 47.80%、TT 20.49%；C和T等位基因频率分别为 55.61%和 44.39%；10 个地区的汉族人群MTHFR677T等位基因频率的趋势性2分析表明
3、MTHFR677T的分布随地理纬度的降低T等位基因频率也降低(P=0.001)。 结论结论中国汉族人群中MTHFRC677T多态性具有依赖地理纬度的地区差异，淮安汉族人群基因型的分布特征与纬度 3530地区一致。全血PCR直接扩增技术简便易行，适用于人群的疾病基因多态性的快速筛检。 关键词：关键词：外周血; 亚甲基四氢叶酸还原酶; 单核苷酸多态; 筛检技术 1. 引引 言言 亚甲基四氢叶酸还原酶( methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR) 是叶酸代谢中的关键酶之一，可将还原型辅酶I (NADPH) 相关的5, 10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢
4、叶酸1。 前者生物学作用为细胞内一碳基团的传递体， 参与嘌呤和嘧啶的合成及DNA修复过程；此外，5-甲基四氢叶酸作为甲基供体，在甲硫氨酸合成酶的催化下，同型半胱氨酸接收甲基基团，生成蛋氨酸，并进一步复甲基化为S-腺苷甲硫氨酸，参与体内广泛的甲基化反应。这一代谢途径的正常运转在维持DNA正常甲基化和核苷酸从头合成以及DNA修复是至关重要的2。目前研究发现MTHFR基因在人群中具有多态性, 最常见的突变是C677T，导致高度保守的丙氨酸突变为缬氨酸， 降低黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)与MTHFR结合能力， 影响MTHFR1基金项目: 国家自然科学基金项目(No. 30571540, 3027036
5、8); 江苏省预防医学科研基金项目(Y2004025); 东南大学国家自然科学基金预研项目(XJ0525212) - 1 -的酶活性和热稳定性3，可能与神经管缺陷、心脑血管疾病和部分癌症发生的遗传易感性有关。 本研究对随机抽取的江苏淮安 205 例健康体检者采用全血PCR直接扩增技术18-19检测MTHFRC677T的多态性，与报道的我国其他地区的汉族人群MTHFRC677T多态性资料进行比较，对MTHFRC677T多态与地理位置的关系进行分析，进一步认识MTHFR第 677 位点多态性在中国汉族人群中的分布特征。 同时， 对MTHFRC677T多态性检测结果与传统PCR-RFLP方法进行比对
6、，并随机抽取 10 例样本进行测序， 以评价全血PCR直接扩增技术在大规模现场人群易感基因筛检中的应用价值。 2. 材料和方法材料和方法 2.1 研究对象研究对象 随机抽取江苏淮安健康体检汉族个体205例，调查研究对象的一般情况和吸烟、饮酒习惯，经调查对象知情同意后，同时抽取外周静脉血5ml，EDTA抗凝，混匀后-20保存备用。研究人群分布特征：年龄1780岁(41.4414.10)，男性127例，女性78例，吸烟个体40.00%，饮酒个体27.80%。 2.2 基因型分析基因型分析 2.2.1 全血样本的全血样本的 MTHFR 目的片断扩增目的片断扩增 留取全血样本1ml直接用于包含MTHF
7、RC677T多态位点的目的片断的扩增。引物序列：上游引物5TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA 3；下游引物5AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG 3； PCR反应体系： 包括用于全血PCR反应的Cocktail PCR Buffer 3.93l， dNTP 200M，引物1M，Taq酶1.25U，加水补充至24l体积，混匀离心后加入全血模板1l。PCR反应条件：94预变性5min；9430s，6030s，7245s，35个循环扩增；72延伸5min。3%琼脂糖凝胶鉴定PCR产物大小应为198bp。 2.2.2 基因组基因组 DNA 的的 MTHFR 目
8、的片断扩增目的片断扩增 取外周全血样本3ml，留取1ml用于全血的直接基因型分析，余2ml全血采用饱和盐析法提取基因组DNA。蒸馏水裂解红细胞后，经蛋白酶K和抽提液处理，0.3M醋酸钠盐析去除蛋白，异丙醇沉淀DNA后用75%乙醇洗涤，晾干，用TE溶解DNA，测定DNA浓度和A260/A280比值。 PCR反应体系包括10buffer 2.5l， MgCl2 1.6l， dNTP 200M， 引物1M， DNA模板1l ，Taq酶1.25U，加水补充至25l体积。PCR反应条件同前。 2.2.3 限制性内切酶分析限制性内切酶分析 上述扩增产物用限制性内切酶 Hinf I 消化，酶切体系：10bu
9、ffer 1.5l，Hinf I 3U，PCR产物 5l，加水补足体积至 15l，37水浴过夜。4%琼脂糖凝胶电泳判断酶切结果：纯合野生型 C/C 仅有一条 198bp 条带；纯合突变型 T/T 可被酶切为 175bp 和 23bp 两个条带；杂合子 C/T 应包括 198bp、175bp 和 23bp 三个条带。 - 2 -http:/ 2.3 统计分析统计分析 应用 SAS8.0 软件进行统计分析， 对全血和基因组 DNA 的 MTHFRC677T 基因型检测方法进行Kappa一致性检验， 并对人群聚集地理纬度与T等位基因频率的关系进行了趋势性2检验。 3. 结果结果 3.1 全血和基因组
10、全血和基因组 DNA 的的 MTHFRC677T 基因型分析基因型分析 分别对同一个体的全血样本采用以Cocktail PCR Buffer为缓冲体系的全血PCR直接扩增技术和提取的基因组DNA采用传统PCR技术扩增MTHFR目的片断，随后以RFLP测定MTHFRC677T基因型，结果见表1，酶切电泳图谱见图1；应用Kappa检验分析了两种方法测定结果的一致性，Kappa0.946，95%可信区间为0.9060.985；表明两种方法检测MTHFRC677T基因型具有高度一致性。 随机抽取基因组模板和对应的全血模板的PCR产物共10例进行测序，测序结果见图2所示，两种方法的测序结果完全吻合，说明
11、以全血为模板、以Cocktail PCR Buffer为缓冲体系的全血PCR直接扩增技术与传统PCR方法检测结果一致。 M: 50bp DNA Marker 泳道1: 纯合野生型C/C 泳道2: 纯合突变型T/T 泳道3: 杂合型C/T 图图1 MTHFRC677T多态的多态的Hinf I 限制性酶切电泳图谱限制性酶切电泳图谱 Figure 1 Electrophoresis profile of MTHFRC677T digested by Hinf I restriction enzyme Sample 1 Sample 2 Sample 3 M 1 2 3 198bp 175bp - 3
12、 -http:/ Sample 1: 纯合野生型C/C Sample 2: 纯合突变型T/T Sample 3: 杂合型C/T (图中箭头所指位点为SNP碱基) 图图2 MTHFRC677T多态的多态的DNA序列测定图谱序列测定图谱 Figure 2 The sequencing profiles of MTHFRC677T genotypes 表表1 全血法和基因组全血法和基因组DNA法的法的MTHFRC677T基因型基因型 Table 1 Distribution of MTHFRC677T genotypes detected with blood sample and with gen
13、omic DNA 基因组DNA法 Detected with genomic DNA 全血法 Detected with blood CC CT TT 合计 Total CC 64 2 1 67 CT 1 94 1 96 TT 0 2 40 42 合计(Total) 65 98 42 205 3.2 遗传平衡检验遗传平衡检验 对提取的基因组DNA采用PCR-RFLP技术测定的MTHFRC677T各基因型频率作Hardy-Weinberg遗传平衡的2检验，结果显示MTHFRC677T各基因型频率与期望值基本吻合，符合Hardy-Weinberg遗传平衡(2=0.205，P0.05)。 3.3 同
14、种族不同地区同种族不同地区MTHFRMTHFRC677T 基因型的分布差异分析 C677T 基因型的分布差异分析 按照研究人群为中国汉族健康个体、有明确MTHFRC677T基因分型资料的标准纳入9个中国大陆不同地区的MTHFRC677T多态性研究，遇有同地区健康人群MTHFRC677T多态性资料，采用最大样本量的研究结果；与本次研究对淮安地区205例健康汉族个体的MTHFRC677T传统PCR-RFLP分型结果共同分析，进行不同地区的中国汉族人群MTHFR第677位点多态性分布频率的比较，各地区资料列表如表2，结果表明，不同地区汉族人群的MTHFR677T等位基因频率有显著差异，2= 97.1
15、62；随人群居住地理位置由高纬度至低纬度677T等位基因频率逐渐降低， 趋势性2检验证实中国汉族人群中该等位基因的分布依赖于人群居住的地理纬度(2= 8.869, P=0.001)； 对各研究人群的MTHFR677T等位基因频率与居住地的纬度之间的相关性分析表明，两者之间存在明显的正直线相关关系，rT,纬度0.917, P=0.0002，排除北京地区研究资料的rT,纬度0.958, P=0.0001。 进一步对纬度进行分级，可见纬度35的东北、河北（石家庄）和山东地区， 35纬度30的陕西（西安）、江苏（淮安）和上海地区，纬度纬度30地区不同年龄阶段（儿童、成人及老年人）的T等位基因频率的分析
16、表明MTHFRC677T多态性与年龄分布无关，结合不同地区MTHFRC677T多态性的分布特征，推测MTHFR677位点的多态性主要受到地理环境的影响， 可能与不同纬度的主导环境致突物对不同居住人群的遗传选择有关。 研究中发现北京的社区对照人群的基因型频率不具有典型的北方分布特征， 考虑由于北京的移民人口较多，地区和生活方式的南北差异已不易分辨，可能存在一定的混杂。 本研究在多态性检测中应用的全血PCR直接扩增技术可以直接采用全血作为PCR反应的模板，与传统PCR-RFLP比较降低了成本、简化了操作，污染机会减少。分析结果表明该方法与传统PCR-RFLP分析结果具有高度一致性(Kappa0.946)，测序结果也说明了这
