复杂生物体系中蛋白质分离分析方法的建立

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1、中国医学科学脘中周协和医科大学顾I ：学位论文A c TA P SB i sB S AD aD T TE S IH P L CI E XI DL C M S 瓜I SM A L D IO DO V Ar p mR P L CP A G ES D SS C X L CT E M E D中英文缩略语表a c r - l a m i d ea m m o n i u mp e r s u l p h a t eb i s a c r y l a m i d eb o v i R es e r u ma l b u m i nd a l t o nd i t h i o t h r e i t o l

2、e l e c t r o s p r a yi o n i z i t i nl l i g hp e r f o r m a n c 圮l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yi n n e rd i m e n s i o nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y r a n d o mm a s ss p e c t r o m ym a t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r

3、p t i o ni o n i z t i o no u R e rd i m e n s i o no v a l b u m i nr o t a t i o np e rm i n u t er e v c r 畿p h a s el i q u i dc h r o m a t o g r p h yp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i ss o d i u md o d e c y ls u l p h a t es t r o n gc m i o ne x c h a n g el i q u i

4、 dc h r o m a t o g r a p h yN N ，N N - t e t r a - m e t h y l e t h y l e n e丙烯酰胺过硫酸铵甲叉双丙烯酰胺牛血清白蛋白道尔顿二硫苏糖醇电喷雾离子化高效液相色谱离子交换色谱内径液相色谱串联质谱基质辅助激光解析离子化外径鸡卵清蛋白转分钟反相色谱聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠强阳离子交换色谱四甲基乙二胺中目医学科学院中国协和医科大学碗J ：学位论文中文摘要基于质谱技术的蛋白质组学已经成为当前生命科学领域的一个研究热点。质谱技术提供了一种快速、灵敏的鉴定蛋白质混合物的方法。但在蛋白质组学研究中，质谱鉴定前多采用对蛋白质

5、混合物酶切，产生更复杂的多肽混合物的样品制备方式，复杂程度过高的样品导致蛋白质鉴定结果的低覆盖率和高假阳性率。基于以上原因，本研究的目的是建立复杂生物体系蛋白质分离方法，在蛋白质水平上进行蛋白质的分离分析，以提高蛋白质鉴定的可靠性，适应蛋白质组学研究发展的需要。本课题的主要工作是在蛋白水平上建立一种简单、高效的蛋白质分离方法，研究对象为血清蛋白谱。具体研究如下：1 ) 通过对不同类型的反相色谱填料C 4 、R 2 、强阳离子交换( S C X ) 色谱填料和新型离子交换色谱填料分离血清蛋白所得色谱结果比较，确定新型离子交换色谱填料具有较高的分离效率；2 ) 优化流动相的流速、样品迸样量和微毛细

6、管柱尺寸。获得最佳分离条件；3 ) 优化梯度洗脱条件，确定分离血清蛋白样品的最佳方法；4 ) 评价分离方法的重现性；5 ) 按照色谱分离峰与时间相结合的办法收集组分，随机选取两组分经过L C - - M S M S 的方法鉴定出可信度) 9 0 的四种蛋自：G a p j u n c t i o nb e t a1 p r o t e i n 、R a s - 3 2 、R a s - 1 0 和C o n s e r v e dh y p o t h e t i c a lp r o t e i n ；6 ) 应用建立的色谱分离方法分离了同一胰腺癌患者术前术后血清，结果表明该色谱方法可以高效

7、的分离蛋白质混合物。本实验建立了简单、高效的复杂生物体系中蛋白质分离方法，它不仅为提高蛋白质鉴定的可信度打下了坚实的基础，同时有可能成为研究疾病发生机制、筛选早期诊断标志物及评估愈后的一种新方法。关键诃：血清蛋白质组，高效液相色谱，质谱，电喷雾离子化中国医学科学院中周协和医科大学硕l ：学位论文A b s t r a c tM a s ss p e c t r o m e t r y ( M S ) - b a s e dp r o t e o m i c sh a sb e c o m eah o ts p o ti nt h el i f es c i e n c er e s e a r

8、 c h M St e c h n o l o g yp r o v i d e sar a p i d i t ya n ds e n s i t i v i t yt od e t e c ta n di d e n t i f yt h ep r o t e i n si nc o m p l e xm i x t u r eo fp r o t e i n s B u tt h ef a l s ep o s i t i v er a t eo fM S b a s e dp r o t e i ni d e n t i f i c a t i o ni sh i g h , w h

9、i c hp a r t l ya r i s ef r o mt h es a m p l ec o m p l e x i t yb e f o r eM Si d e n t i f i c a t i o n M o s tc o m m o n l yu s e dm e t h o dc a l l e d “s h o t g u n i st h a tt h ea n a l y t e sb e f o r eb e i n gi n t r o d u c e di n t ot h em a s ss p e c t r o m e t e ra r ep e p t

10、i d e sg e n e r a t e db ye n z y m a t i cc l e a v a g eo fam i x t u r eo fp r o t e i n s ，w h i c hc o m m o n l yr e s u l t si nc o n s e q u e n c eo ft h el i m i t e ds e q u e n c ec o v e r a g ea n dh i g hf a l s ep o s i t i v er a t e s B a s e du p o nt h ea b o v e - m e n t i o n

11、 e df a c t , O U ra i mi st oe s t a b l i s has i m p l ea n de f f e c t i v em e t h o df o rs e p a r a t i n gap r o t e i nm i x t u r ef r o mc o m p l e xb i o l o g i c a ls y s t e m , w h i c hc a ns a t i s f yt h en e e do f p r o t c o m i c sd e v e l o p m e n t O u rs t u d ym a i

12、n l yf o c u s e so ne s t a b l i s h i n gas i m p l ea n de f f i c i e n ts e p a r a t i o nm e t h o do nt h em o l e c u l a rl e v e lo f p r o t e i n s T h ei n v e s t i g a t i o n sa r ea sf o l l o w s ：1 ) T od e t e r m i n eak i n do fn e wi o ne x c h a n g ep a c k i n gm a t e r

13、i a l ss u p e r i o rO V e rd i f f e r e n tk i n d so fc h r o m a t o g r a p h i cp a c k i n gm a t e r i a l s , s u c ha sC 4 ，R 2 ，s t r o n gc a t i o ne x c h a n g ei nt h ep r o c e s so fs e p a r a t i n gc o m p l e xp r o t e i n si ns e r u m ；2 ) T oo p t i m i z ea n dg e tt h eb

14、 e s ts e p a r a t i v ec o n d i t i o n sb yc o m p a r a t i v ee x p e r i m e n t sa d o p t i n gd i f f e r e n tf l o wm t e s , t h el o a d e dq u a n t i t ya n dt h ed i m e n s i o no fc a p i l l a r y ；3 ) T oo p t i m i z et h eb e s tg r a d i e n te l u t i o np a a e r nf o rt h

15、es e p a r a t i o no fs e r u m ；4 ) T oe v a l u a t et h er e p r o d u c t i v i t yo ft h es e p a r a t i o nm e t h o d ；5 ) A c c o r d i n gt oc h r o m a t o g r a p h i cp e a ka n dt i m e ，t w of r a c t i o n sW e r es e l e c t e dr a n d o m l y , f o l l o w e db yL C M S ，M Sa n a

16、l y s i s ，a n dg a pj u n c t i o nb e t alp r o t e i n 、r a sa s s o c i a t e dp r o t e i n 3 2 、r a sa s s o d a t e dp r o t e i n l 0a n dc o n s e r v e dh y p o t h e t i c a lp r o t e i nw e r ei d e n t i f i e dw i t hc o n f i d e n c eo fg r e a t e rt h a n9 0 N o t a b l e l y , f o u rp r o t e i n si d e n t i f i e dh e r e i nw e r ea l ll o w - a b u n d a n c ep r o t e i n s ；6 ) T h i ss e p a r a t i o nm e t h o de s t a b l i s h e dh e r e i