《KPNA2在食管鳞癌中的表达及临床意义研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《KPNA2在食管鳞癌中的表达及临床意义研究（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 嬲嬲必， K P N A 2 在食管鳞癌中的表达及临床意义研究摘要目的：分析K P N A 2 在食管鳞癌中的表达水平并探讨其与食管鳞癌临床病理特征的关系，为预测食管鳞癌的浸润、转移提供依据。方法：收集标本：收集泸州医学院胸外科2 0 1 0 年3 月- + 2 0 1 0 年1 2 月行手术治疗的食管鳞癌病例4 0 例的癌组织及癌旁正常食管组织。R T - P C R 法：从转录水平上检测妯N A 2 在食管鳞癌及癌旁正常食管组织中的表达情况。免疫组化法：采用H E 染色和免疫组织化学( L S A B ) 染色，检测K P N A 2 蛋白在食管鳞癌癌组织及癌旁正常食管组织中的表达水平及
2、其与食管鳞癌各临床病理因素的相互关系。所有统计资料均采用S P S S1 3 0f o rW i n d o w s 进行数据分析。各临床病理特征组组间差异用X 2 检验，P 2 倍) ，而且K P N A 2 表达水平与乳腺癌总体生存和无瘤生存呈负相关，是个独立的危险因素。2 0 0 7 年D a n k o fA t 7 1 等对乳腺癌旁正常组织、乳腺导管原位癌( D C I S ) 癌组织进行免疫组化实验，结果发现K P N A 2 在乳腺浸润癌及原位癌中均高表达。并且通过统计分析指出：K P N A 2 的表达与肿瘤的分级、分期及淋巴管浸润呈正相关。提示K P N A 2 与乳腺癌的发
3、生发展有着重要的关系。T h a k u r 等【8 】也证明B R C A l ( 家族性乳腺癌易感基因) 蛋白是通过K P N A 路径进入核内，B R C A l的亚细胞分配受K P N A 2 的影响，因此推测K P N A 2 的表达与乳腺癌相关。另有报道【9 1 称K P N A 2 基因表达与皮肤黑色素瘤有无远处转移相关，对黑色素瘤发生、发展有一定作用。国内目前没有关于K P N A 2 与食管癌关系的研究报道，国外仅见一篇文献报道，是日本学者M A K O T OS A K A I 1 0 1 对食管鳞癌组织进行免疫组化实验，结果发现5 1 7 的食管鳞癌中高表达K P N A
4、 2 ，同时显示：K P N A 2 的表达与肿瘤的分级，分期及淋巴管浸润呈正相关。本课题采用逆转录聚合酶链式反应( R T - P C R ) 和免疫组化技术检测食管鳞癌组织及癌旁正常食管组织中K P N A 2m R N A 及其蛋白的表达，并结合临床病理特征进行分析，旨在探讨K P N A 2 基因在食管鳞癌中的表达及其与临床病理特征和预后间的关系。材料与方法1 临床资料1 1 病例的选入标准食管鳞癌病例选择：收集泸州医学院胸外科2 0 1 0 年3 月2 0 1 0 年1 2 月行手术治疗的食管鳞癌病例。入选标准：所有病例患者均行食管鳞癌根治术，术后病理确诊为食管鳞癌。所有病例患者术前
5、均未接受化疗、放疗和其他治疗。有详细临床病历资料。无合并其他器官疾病。癌旁正常食管病例选择：取食管鳞癌手术切除后，癌旁5c m 以上的正常食管组织，术后病理确诊为正常食管组织。1 2 食管鳞癌病例的临床资料入选的食管鳞癌及癌旁正常食管组织各4 0 6 0 ，其中男t 生3 0 6 0 ，女性1 0例，年龄4 2 8 2 岁，所有病例术后病理均确诊为食管鳞癌。所有患者临床资料完整，全组食管鳞癌均按中国常见恶性肿瘤诊治规范的标准进行组织学分型及l 临床T N M 分期，病理类型4 0 例全为鳞癌。病理分级为高分化1 3例，中分化1 8 例、低分化9 例，经病理证实有淋巴结转移者2 2 例，无转移者
6、18 6 0 。肿瘤组织均在原发灶取材，避开坏死、炎症区域；癌旁正常食管粘膜组织取自肿块边缘5c m 以上的食管组织，常规病理切片证实为正常食管组织。标本在肿瘤切除后3 0m i n 内采集。所有标本组织分成两份：一份经1 0 中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4u m 厚连续切片，进行H E 染色和免疫组织化学染色；另一份组织标本放置于8 0 冰箱保存。所有患者均有完整的临床病历资料。2 主要实验试剂组织总R N A 抽提试剂T R I z o lI n v i t r i g e nR e v e r T r aA c ed N T P M i xT a p 酶d N T PM i x t u
7、r eM a r k e rIM M L V 逆转录酶T o y o b oB i o B R KB i o B R KB i o B R KT a k a r aP r o m e g a免疫组化染色试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司K P N A 2 单抗D E P CD A B 显色剂其他试剂均为分析纯3 主要实验仪器倒置相差显微镜8 0 低温冰箱纯水器K u b o t a 台式离心机超低温高速离心机P C R 扩增仪电泳仪紫外凝胶成像分析系统美国S a n t a 公司编号：S C 5 5 5 3 8I n v i t r i g e n博士德生物工程有限公司日本O L Y M P
8、U SI X 7 1 A 2 1 P HM C O 15 A C 日本S A N Y O美国B a m s t e a d 公司美国德国E P E N D O R F 公司T h e r m a lm a s t e r c y c l eg r a d i e n t ，E p p e n d o r f北京六一仪器厂D Y Y - 6 C 型F U J I F I L ML A S 3 0 094 实验方法4 1R T - P C R 检测食管鳞癌及癌旁正常食管组织K P N A 2m R N A 的水平4 1 1 引物设计引物设计与合成：由上海生工生物公司设计合成，K P N A 2 扩
9、增产物长度为2 4 7b p ，退火温度为5 6 “ C ，G A P D H 扩增产物长度茭J 4 5 0b p ，退火温度为5 6 ；具体引物序列如下：K P N A 2 ：s e n s ep r i m e r ：5 - C A A G G C T G T G G T A G A T G G 3 A n t i s e n s ep r i m e r ：5 一G C G G C A A A G A T T A G A A A G 一3 G A P D H ：s e n s ep r i m e r ：5 一A C C A C A G T C C A T G C C A T C A C
10、 - 3 A n t i s e n s ep r i m e r ：5 一T C C A C C A C C C T G T T G C T G T A 一3 4 1 2 组织总R N A 的提取按T R I Z O L 试剂使用说明抽提组织R N A 。将抽提的R N A 进行O D 值( 2 6 0 2 8 0 ) 和浓度检测，要求O D 值在1 8 2 0之间，浓度在5 0 0n g u l 以上，否则重新抽提，根据R N A I 约浓度进行稀释，以使做R T 反应时反应体系中R N A 的含量在lHg 左右，不超过ll ag 为宜。4 1 3R T ( 逆转录)取每例组织R N Ax
11、l al ，按以下体系逐次加样( 体积2 0l l1 )R N AR N a s eF r e eH 2 05XI 汀B u f f e rd N T PM i x t u r e ( e a c h10 m M )S u p e r - R IR t E n h a n c e rP r i m e rO l i g o ( d t ) 18 ( 5 0 p m o l u 1 )R e v e rT 】r a A c eXUl1 1 XBl4U12UlO 5UlO 5U1lpl1UlT o t a lV o l u m e2 0Ull O将上述反应液置入P C R 仪中分别进行3 0 1
12、0m i n 4 2 2 0m i n ，9 9 。C5 m i n ，4 。C5m i n 反应( x 的量根据R N A 的浓度调整，保证反应体系中R N A 的含量为1l ag 左右，不超过1ug 为宜) 。4 。C ，冷却，2 0 。C 保存c D N A 。4 1 4P C R取2l al 稀释后的c D N A 作为模板进行P C R 反应；按照下列体系逐一加入反应成分：逆转录反应后原液R N a s eF r e eH 2 0序列特异的上游引物序列特异的下游引物2 XT a qP C RM a s t e r M i x2pl6Ullpl1Ul1OUlT o t a lV o l
13、 u m e2 0U1三三差；毛I三三i二-3 。c y c e s食管鳞癌组织和癌旁正常食管组织中K P N A 2 的m R N A 的表达水平的差异性，P 6 0 岁2 1O 0 5 ) 、性别( X 2 = O 3 0 7 ，P 0 0 5 ) 之间差异无统计学意义。K P N A 2 蛋白在高分化癌鳞中的阳性表达率为3 8 4 ( 5 1 3 ) 在中、低分化鳞癌中的阳性表达率分别为6 1 1 ( 1 1 1 8 ) 和7 7 7 ( 7 9 ) ，三组之间的差异有统计学意义( X 2 = 5 2 4 2 ，P = 0 0 2 2 ) 。多组无序多分类资料的相关分析显示，N A 邪日
14、性表达与肿瘤分化程度呈正相关( r = 0 3 4 1 ，P =o 0 0 1 ) 。K P N A 2 蛋白在浅层浸润组( T I + T 2 ) 中的阳性表达率为4 3 5 ( 1 0 2 3 ) ；在深层浸润组( T 3 + T 4 ) 中的阳性表达率为7 6 5 ( 1 3 1 7 ) ，两组之间的差异有统计学意义( X 2 = 4 3 5 0 ，P = 0 0 3 7 ) ；相关分析显示K P N A 2阳性表达与肿瘤浸润深度呈正相关( r = 0 2 8 2 ，P = 0 0 4 1 ) ；在有淋巴结转移组K P N A 2 蛋白的阳性表达率为7 7 3 ( 1 7 2 2 ) ，
15、在无淋巴结转移组的阳性表达率为3 3 3 ( 6 1 8 ) ，有淋巴结转移组的表达显著高于无淋巴结转移组( X 2 = 7 8 2 1 ，P = 0 0 0 5 ) ；相关分析显示，N A 2 阳性表达与肿瘤有无转移呈正相关( r = O 31 5 ，P = 0 0 3 5 ) ；食管鳞癌组织中K P N A 2 蛋白的表达与患者的年龄、性别因素无相关性( 尸 O 0 5 ) ；K P N A 2 蛋白与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和分化程度密切相关。讨论1 食管鳞癌的研究现状肿瘤的发生是细胞内一系列分子变化的结果，这些分子变化导致了许多基因表达水平的变化，从而导致了肿瘤的不同表型和特征，伴随着
16、不同的组织学类型和临床分期的差异。目前食管癌是全球最常见的十大恶性肿瘤之一，几乎发生在全世界所有国家及民族，有报道统计称，全球每年大约有3 0 万的新发食管癌病例，并且大部分病例发生在发展中国家。在组织学上食管肿瘤主要有鳞状细胞癌和腺癌两种类型，这两类肿瘤在病因学和病理学的特征有很大区别。在西方国家腺癌多见，有文献称在美国食管腺癌占食管癌总数的5 0 左右 1 2 】。在我国食管癌居肿瘤死亡的第4 位，并且以食管鳞状细胞癌为主【13 1 。近年来，对食管癌病因和发病机制的研究虽己取得重大进展，但其关键因素尚未完全阐明，发病率和死亡率在有的地区仍居高不下。随着分子生物学技术的发展，很多新技术的出现，促进了基因学和遗传学的研究并取得了很大进步，许多的染色体突变及癌基因、抑癌基因、细胞周期调节基因等与食管癌发生的关系被逐渐阐明。大量研究表明，食管
