分子生物学 第九章 DNA重组技术

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1、第 九 章DNA重组技术对多数生物来说，基因本质是DNA，基 因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列 的重新组合和建造，所以基因工程的核 心就是人工的DNA重组（重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才 有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。 纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克 隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。 所以DNA重组和分子克隆是与基因工程 密切不可分的，是基因工程技术的核心 和主要组成部分。重组DNA、分子克隆 甚至成了基因工程的代名词。基因工程属于生物技术范畴，广义的生物技术指任 何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物 品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技 术和单克隆

2、技术为标志发展起来的新技术。一般认 为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工 程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术 的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术 的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生 物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的 。生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和 细胞融合技术最为突出。蛋白质工程则是在基因工 程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机 学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域， 开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的 新时期，被称为第二代基因工程。第一节 工具酶 一、限制性核酸内切酶的概念 核酸酶可分为两类：核酸外切酶是

3、从核酸的一 端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切 酶则从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸 链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并 将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异 的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切 断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲 基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基 化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异 的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细 胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身 的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信 息的稳定。二、限制性核酸内切酶的命名 按酶的来源的属、种名而定，取属

4、名 的第一个字母与种名的头两个字母组成的 三个斜体字母作略语表示；如有株名，再 加上一个字母，其后再按发现的先后写上 罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（ Haemophilus influenzae d）中先后分离到 3种限制酶，则分别命名为Hind、Hind 和Hind。三、限制性核酸内切酶的分类 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情 况不同，分为三类： 类限制性核酸内切酶 由3种不同亚基构成，兼具 有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识 别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点 以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类 酶的作用需要

5、Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。 类限制性核酸内切酶 与类酶相似，是多亚蛋白 质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别 序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要 ATP供给能量。 类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成，仅需 Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切 断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常 在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指类酶而 言。四、限制性核酸内切酶的作用 大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有 回文结构特征，切断的双链DNA都产生5磷酸基 和3羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切 割的特异性不同，结果

6、有三种不同的情况： 产生3突出粘性末端（cohesive end）:以 Eoor 为例： 5GAATT C35Gp OHTTAAC3 3C ATAAG5EooP 3 CTTAAOH pG5 产生5突出的粘性末端：以Pst为例 ： 5CTGCAG35CTGCAp OHG3 3GACGTC5Pst 3GOH pACGTC5 产生平末端（blunt end）:Nru 为例 ： 5TCGCGA35TCGp OHCGA3 3AGCGCT5Nru 3AGCOh pGCT5DNA重组技术中最常用的工具酶 酶 主要用途 限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列，切断DNA链 DNA聚合酶 或 其大片段（ Klen

7、ow）缺口平移制作标记DNA探针 合成cDNA 的第二链 填补双链DNA3凹端 DNA 序列分析 耐热DNA聚合酶 （Taq DNA聚合酶聚合酶链反应（PCR）DNA连接酶连接两个DNA分子或片段 多核苷酸激酶催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端 标记探针 末端转移酶在3末端加入同质多聚物尾SI核酸酶，绿豆核 酸酶降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变 为平端 DNA端酶降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 RNA酶A降解除RNA 磷酸酶切除核酸末端磷酸基第二节 重组DNA载体理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： 能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自 主复制能力。 容易

8、进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主 细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的 限制性核酸内切酶位点。 容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组 操作。 有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或 携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分 离出来。这才介于克隆操作。一、质粒载体 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然 形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，15kb的 小质粒比较容易分离纯化

9、，15kb的大质粒则不易提取。能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制 的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。每个质粒DNA上都有 复制的起点，的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中， 随宿主DNA复制，称为附加体。质粒对宿主生存并不是必需的。质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也 不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细 胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗 药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表 霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒， 带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以 质粒对宿主不是寄生的，

10、而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中 天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的 实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体，近 年来发展很快，新的有特定用途的质粒不断被创建。图给出 最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图谱，此质粒的复 制起点处序列经过改造，能高频率起动质粒复制，使一个细 菌pUC19的拷贝数可达500-700个。二、噬菌体载体 噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大 ，如噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。 噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子 ，组装在头

11、部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。噬菌体感染时 ，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。 DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖（图）：溶菌性方式：利用宿主菌中的酶类和原料，DNA上基因可按调控的 顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，DNA经多 次复制合成许多子代DNA，于是装配成许多子代的噬菌体，最后裂菌 ，释放出许多新的噬菌体。溶原性方式：进入细菌的DNA可整合入细菌的染色质DNA中，随细 菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA 中的DNA称为原噬菌体，含有原噬菌体的细

12、菌称为溶源菌 利用噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA 替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬 菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而 繁殖。现在广泛使用的噬菌体载体也是已作过许 多人工改造的，主要的改造是：设计去除DNA 上的一些限制性酶切点。这是因为DNA较大，序 列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。在中段 非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝 白筛选lacI-lacZ序列，和多克隆位点等。由此可构 建出两类噬菌体作载体；一类是插入型载体，可 将外来序列插中段，常用的gt系列载体，一般容 许插入5-7kb外来DNA；另一类是转换型载体，即 可用外来DNA替代中段，如IM

13、BL系列载体。三、动物病毒载体 感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的 培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都 把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序 列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前 病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒SV40、逆转录病毒和昆 虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序 列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等人基因组十分庞大，约含4109bp，建立和筛选人的基因组文 库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（YAC）载体 应运而生。YAC含有酵母染色体端粒、着丝点及复制起点等 功能序列，

14、可插入长度达200-500kb的外源DNA，导入酵母细 胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究 计划的重要载体。第三节 目的序列与载体的连接一、粘性末端连接 如果目的序列两端 有与载体上相同的限制 性核酸内切酶位点，则 同一限制酶切开产生的 粘末端，在降低温度退 火时，能重新互补结合 ，在DNA连接酶催化下 ，目的序列就与载体 DNA链相连接（图:同一 限制酶切割DNA粘性末 端的连接）。如果在连接的两个DNA片段没有能互补的粘性末端，可用末端核苷酸转移酶催化脱 氨单核苷酸添加DNA的3末端，例如一般DNA3端加上polyG，另一股DNA加上polyC，这样人工在DNA两端做出

15、能互补的共核苷酸多聚物粘性末端，退火后能结合连接（图），这样方法称为同聚物加尾法。二、平末端连接 T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合， 则可用适当的酶将DNA突出的末端削平或补齐成平末端，再用T4DNA连接酶连接，但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。对平末端的DNA，也可先连上人工设计合成的脱氧 寡核苷酸双链接头，使DNA末端产生新的限制内切 酶位点，经内切酶割后，即可按粘性末端相连（图: 人工接头连接法）。第四节 目的基因序列的来源和分离一、基因组DNA文库 从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方 法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸 内切酶的不完全酶解）将DNA降解成预期大小的 片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌 体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细 胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA 片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖 扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA 片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库（ genomic DNA library）。基因组文库是具有生物 种属特异性的。构建基因组文库，再用分子杂交等技术去 钓取基因