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1、双抗体夹心 ELISA 法检测狂犬病疫苗抗原活性组分王玉琳 封多佳 吕宏亮 李 薇 马 超 魏至栋 ( 卫生部兰州生物制品研究所, 兰州 730046)摘 要 采用多克隆双抗体夹心 ELISA 法快速检测狂犬病毒抗原含量。 结果表明, 灵敏度达到 15 g/ ml, 同时特异性及变异系数均合乎要求。 本方法用于精制狂苗制备过程中有效抗原活性组分的检测准确、快速、重复性好, 且抗原的 ELISA 效价与 NIH 动物法测定效价具有平行趋势。关键词 双抗体夹心 ELISA 狂犬病毒 抗原分类号 R373. 9Antigenic components detection on rabies vacc
2、ine by double -antibody sandwich ELISA Wang Y ulin, FengDuojia , L Hongliang, et al. (Lanzhou Institute of Biological Products, Lanzhou 730046)Abstract The rabiesvirus antigen contents were detected by double -antibody sandwich ELISA assay us-ing polyclonal antibody. The results showed that the sens
3、itivity can reach to 15 ug/ml and the specificity andvariance can be controlled. The assay can be used for detecting the active antigen during vaccine -purifying pro-cess and it is accurate, quick, and repeatable. The titers of ELISA is parallel to the animal potencies of NIH.Key words Double -antib
4、ody sandwich ELISA Rabies virus Antigen狂犬病毒抗原含量是狂犬病疫苗的主要质量指标之一 ,在精制狂犬病疫苗的研制过程 中常需要及时进行抗原的检测, 多年来一直用NIH 动物法测定。该方法测定周期长, 不适用于提纯过程中各步骤的监测。北京生物制品研 究所建立了 ELISA 间接法1检测抗原量( 抗原包被 、 抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体、 酶标第二抗体显色) ,但该方法只能检测狂犬病毒的糖蛋 白亚单位而无法测定其它亚单位组分 ,且抗原包被需 4过夜, 出结果要在 14 小时以后 , 使其应用具有一定局限性。本文用双抗体夹心 ELISA 法检测狂犬病毒抗原 ,
5、敏感性高、特异性强、简便易行、价格低廉 ,可提前用抗体包被板孔 ,无需特殊试剂 ,3 小时以内便得到检测结 果,大大提高了工作效率 ,同时也为狂犬病疫苗精制方法和工艺的筛选 、确定和优化提供了依据。 1 材料和方法1. 1 材料1. 1. 1 马抗狂犬病毒多抗血清 血清效价100 IU/ml。 兰州生研所制备。1. 1. 2 辣根过氧化物酶 购自 Sigma 公司。1. 1. 3 疫苗样品 浓缩狂犬病疫苗、精制狂犬病疫苗, 兰州生研所制备。1. 2 方法1. 2. 1 抗体提纯 分别用 50%和 33%饱和硫酸铵两次提纯马抗狂犬病毒血清 IgG 抗体2。1. 2. 2 辣根过氧化物酶标记抗体的
6、制备 用改良过碘酸钠法标记提纯的马抗 RVIgG3。1. 2. 3 包被抗体及酶标记抗体工作浓度的确定 采用方阵滴定法4。 将提纯马抗 RVIgG 分别以 1 100、1 200、1 400、1 800 的稀释度包被, 以浓缩狂犬病疫苗( 98005 批, 效力为 4. 68 IU/ 2ml) 作为抗原, 将未知浓度的酶标记抗体分别作系列稀释, 确定最佳工作浓度。按常规双抗体夹心 ELISA 法将每孔 100 l 抗体包被后, 4过夜; 加入待检抗原 100 l/孔, 37孵育 1 h; 再加入酶标记抗体 100 l/ 孔, 37孵育 1 h; 最后加入底物液显色 10 min, 用2 mol
7、/ L H2SO4中止反应。 酶标仪31微生物学免疫学进展 1999 年第 27 卷第 3 期 测定每孔 O. D450值, P/ N 2. 1 且 A4500. 1 时的抗原最高稀释度作为疫苗的相对 ELISA 效价。1. 2. 4 测定方法的技术指标 灵敏度、特异性及精密度的检测 方法参照 1993 年版 中国生物制品规程5( 二部) 。1. 2. 5 NIH 动物法效力试验 按 1995 年版中国生物制品规程6执行。2 结果2. 1 十字交叉方阵法滴定 包被抗体浓度为 1 400, 酶标记抗体浓度确定为 1 1000。2. 2 滴定方法技术指标 2. 2. 1 灵敏度 ELISA 法检测
8、灵敏度下限为15 g/ml( 以精制狂犬病疫苗 98012 批作为抗原 ,效力为 3. 68 IU/2ml , 蛋白含量为 120 g/ml) 。 2. 2. 2 特异性 用本法对狂犬病疫苗制造过程中使用的各种液体如细胞培养液、人血白蛋白 、 小牛血清 、 地鼠肾细胞悬液以及单纯疱疹病毒抗原按 1. 2 方法进行检测 ,结果均为阴性,无 非特异反应 。2. 2. 3 精密度 CV 值为( 9. 85 2. 86) %。2. 3 狂犬病疫苗精制过程中各组份的动态监测 浓缩狂犬病疫苗经 DEAE Sepharose CL-6B 层析, 用 ELISA 法检测, 抗原活性峰与层析后蛋白峰 C 吻合(
9、 图 1) ,并经 NIH 法效价测定确认为狂犬病毒抗原活性峰 。图 1 浓缩狂犬病疫苗 DEAE Sepharose CL 6B 层析图谱Fig . 1 Profile Concentrated Rabies Vaccine by DEAE Sepharose CL-6B Chromatography2. 4 精制狂犬病疫苗半成品效价测定连续对 6 批精制狂犬病疫苗进行 ELISA效价和 NIH 动物法效价测定, 两种方法测定结 果虽未有对应比值 ,但明显呈正相关趋势 。结果见表 1。3 讨论抗原含量低 、疫苗接种副反应强是国产浓缩狂犬病疫苗的主要质量问题 ,国外发达国家目前均使用各种精制疫
10、苗, 为使国内使用更为 安全有效的狂犬病疫苗, 研制和生产精制狂犬病疫苗势在必行 。但在其研制过程中常涉及狂犬病毒抗原的快速检测 。本文采用多克隆双抗体夹心 ELISA 法进行检测 , 国内外尚未见报道 。该法基本上能达到快速、准确检测纯化过程中各有效抗原组份的目的 ,且重复性好 。32微生物学免疫学进展 1999 年第 27 卷第 3 期表 1 连续 6 批精制狂犬病疫苗 ELISA 效价和 NIH 效价测定结果Tab. 1 The Results of NIH and ELISA Potency on Continuous6 Batches of Purified Rabies Vacci
11、neSample No .ELISANIH98011 328. 6998021 165. 8598031 83. 3798041 3210. 6498051 164. 6598061 42. 93: NIH potency expressed as IU/2ml本法测定的有关技术指标均符合 1993 年版规程要求,若在抗体效价最高时采集马血清 , 则敏感性会进一步提高 ; 同时本法检测无非特异性反应,说明了本所制备的马抗 RV 血清中几乎不含有抗地鼠肾细胞 、 人血清白蛋白、 小牛血清及细胞培养液的成分 ,也说明用于制备该 血清的抗原纯度较高。因此, 使用这种马抗RV 血清制备的精制抗狂犬病毒
12、血清是安全可靠的 。 从表 1 可见 ,ELISA 效价与 NIH 动物法效价相比,两者虽具有一定的正相关趋势 ,但仍有较大差异, 主要有以下几个原因: 第一, 两者没有同时检测。在纯化过程中往往是收集样品后 立刻测定其 ELISA 效价, 但 NIH 动物法效价往往要间隔一个月左右才测定 ,且各批精制疫苗间隔时间不等 ; 第二, 阳性参比品不一致 。ELISA 测定时, 用不同批经 NIH 动物法测定效 价合格的 30 倍浓缩狂犬病疫苗作为阳性对照 ,NIH 动物法效价测定时采用的是中国药品生物制品检定所提供的参考品 ,也并非同批 ,所以结果会有差异; 第三 , NIH 动物法效力试验有 时
13、也会因批间试验动物的差异及人员操作的影响而引进较大的误差, 这些问题都有待改进。为了减少 ELISA 检测的批间差异, 采用同 一批抗原作为阳性对照来调节各批的 ELISA结果, 以保证纯化过程中各组份有效抗原含量检测结果的一致性和可比性 。在比较精制狂犬病疫苗的 ELISA 效价及 NIH 效价时 , 二者应 同时测定,样品也应一致。4 参考文献1 曾鸣, 王玉琳, 梁勇, 等. ELISA 法和 NIH 法检测狂犬病疫苗抗原量的比较研究 .微生物学免疫学进展, 1996, 24( 3) : 20-22.2 杜平主编.医用实验病毒学.上海微生物学会, 1982, 137-142.3 朱培坤编.酶免疫技术.第一版.山东科学技术出版社,1983, 47-61.4 徐宜为编.免疫检测技术 .第二版.科学出版社, 1997,167-182.5 中国生物制品规程( 二部) . 1993 年版, 116.6 中国生物制品规程( 一部) . 1995 年版, 110-114.( 收稿 1999 -05-26)33微生物学免疫学进展 1999 年第 27 卷第 3 期
