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1、中文摘要摘要近十几年来新药的数量呈现出逐渐下降的趋势，面对着周期长、成本高且成功率低的迫切问题，何种策略对新药研发是行之有效的，一直是个争论不休的话题。尽管有大量的活性物质在体外筛选中被发现，然而令人费解的是很多在体外药理活性高的化合物一旦在进入动物或临床试验后往往药效差强人意，这也就导致了许多候选药物在后期研发中被淘汰。然而，引起这种活性差异的原因仍然是一个“黑匣子”，这也成为了现代药物研发中关注的焦点，是值得我们深入探究的问题。药物在体外筛选与体内发挥作用的真实环境差异可能是其中的原因之一，一个最明显区别就是体外的静态筛选与体内的动态环境之差。药物进入体内一般会经过吸收、分布、代谢等过程来
2、发挥作用，然而这些过程都与血液循环系统密切相关，特别是微循环系统作为机体进行物质交换的场所，它是否在引起这种体内外药物活性差异中扮演着什么重要角色。基于此，本实验以内皮细胞为研究对象，丹参为模型药物，借助于流动腔加载以实现模拟在体微血流的流动环境，拟初步建立一种动态的药物筛选方法，以考察动态筛选与静态筛选之间是否存在细胞对药物吸收和代谢的差异。生物力学及生物力药理学的迅速发展为提出一种新的动态筛选策略提供了强大的理论依据。本课题的主要研究内容和实验结果如下所示：基于在体微血管的生理环境( 1 - 5 d y r d c m 2 剪切力直接作用于内皮细胞) ，建立了一套体外模拟微血流的系统，由平
3、板流动腔、恒流泵、硅胶管和储液瓶构成。该系统能提供二维稳定的分散状层流。通过对流动系统的校正，得到恒流泵各转速与对应的流体流量之间呈现出良好的线性关系，相关系数r 为0 9 9 9 。采用乌氏粘度计测得灌流液在3 7 “ ( 2 下的粘度为6 6 8 4 1 0 0 d y n s c m 2 ，并根据剪切力公式，拟合恒流泵各转速与对应剪切力之间良好的线性关系，相关系数r = O 9 9 9 。并推算出实验所需的微血流剪切力f = 1 5d y n c m 2 ，3 0d y n c m 2 和4 5 d y n c m 2 时，对应的转速分别为O 18 r p m ，0 2 8 r p m
4、和0 3 8 r p m 。以丹参提取物作为模型药物，考察了不同浓度的丹参提取物( 1 5 1 t g m L 、3 0 p g m L 、6 0 1 x g m L 、l O O u g m L 、2 0 0 肛g m L 、4 0 0 1 x g m L ) 对内皮细胞活力的影响，实验结果表明1 0 0 p g m I “0 0 p 虮I l L 对细胞活力有显著影响，并在1 0 0 1 x g m L 达到最大活力1 1 9 5 0 ，相对于正常对照组活力提高了1 9 5 0 。将丹参提取物原液进行L C M S 分析，发现1 2 个物质峰，通过分析质谱数据及参考丹参成分的相关文献，从中
5、推断出1 1 个成分，包括丹参素、丹酚酸A 、丹酚酸J 、咖啡酸、二氢丹重庆大学硕士学位论文参酮I 、丹酚酸B 、迷迭香酸甲酯、丹酚酸D 、原儿茶醛、亚甲基丹参醌和迷迭香酸，以及一个未知成分。通过对给药后静态模型和动态模型的细胞解离液进行L C M S 检测，发现它们都对丹参素、二氢丹参酮I 、咖啡酸、丹酚酸B 、亚甲基丹参醌、丹酚酸D 和丹酚酸A 这7 个成分有吸收，这些成分可能与血管活性的功效有关；另外，与静态模型相比，在动态模型的细胞解离液中，发现一个未知成分峰，通过与空白细胞解离液和药材原液谱图比较均未发现，推测其可能是药物与细胞在微血流条件下作用后产生的某种代谢物。在微血流的给药时间
6、梯度( 1 h 、2 h 、3 h ) 考察下，动态模型均对这7 个成分有吸收，而且在不同加载时间的作用下于不同时间各出现一个未知成分峰，通过谱图对比，推测这些未知成分可能为代谢物。由此可见，相对于静态细胞模型来说，在微血流拟态下，细胞对药物的吸收代谢是有影响的，并且随着药物作用时间的增加，对其吸收代谢会产生不同的影响。通过考察静态模型( f 0 ) 、恒流模型( 俨1 5 d y n e m 2 ) 和梯度流模型( f 1 5 3 0 - 4 5d y n c m 2 ) 三种不同给药情况下，细胞对药物吸收代谢的影响，结果发现它们均对丹参提取物中的7 个成分有吸收，包括丹参素、二氢丹参酮I
7、、咖啡酸、丹酚酸B 、亚甲基丹参醌、丹酚酸D 和丹酚酸A 。然而在恒流模型中出现1 个未知成分峰，在梯度流模型的细胞解离液中发现了3 个未知成分峰，通过与空白细胞解离液和药材原液谱图比较均未发现，1 推测这些未知成分可能为药物与细胞在微血流条件下作用后产生的某种代谢物，而静态模型没有未知成分峰的出现。由此可推断，与静态相比较，在微血流条件下动态的药物筛选环境会影响细胞对药物的吸收代谢，并且梯度流的剪切力这种影响作用更明显。通过考察H 2 0 2 不同浓度( 7 5 p m o l L 、15 0 I _ t m o l L 、3 0 0 m a o l L 、6 0 0 9 m o l L 、
8、1 2 0 0 p a n o l L ) 作用于内皮细胞不同时间( 0 5 h 、l h 、2 h ) ，结果发现H 2 0 23 0 0 I _ t m o l L -1 2 0 0 l - t r n o l L 让细胞活性明显下降，与正常对照组比较均有显著性差异俨 H ，W H ，并使流动小槽中间段的流动状态得到充分发展瞄】。本实验所设计的平板流动腔为L = 7 5 c m ，W = 2 5 c m ，H = 0 2 r m n ，基本满足了上述要求( H - 几= O 2 7 ，2 体外模拟微血流培养系统的建立H W - - 0 5 8 ) ，故可保证小槽内大部分区域的流体达N -
9、- 维稳定的层流状态。另外，在流体的入口和出1 3 处各设计了一个起缓冲和发散作用的三角形腔，可使进入的流体沿缓冲带分散开来，有效地保证了流动小槽的入口处即得分散状的层流。2 3 2 流动参数的估算流动系统的校正按照实验方法测定恒流泵各转速对应的流体流量，结果如表2 1 。表2 1 恒流泵各转速与流量的关系! 垫! 曼：至：! ! 缝! 呈! 型i 旦璺兰塾垃垒曼! 竖皇坠塑! 璺型塑皇盟垡! ! Q 婴盥望望墨型! ! 竺型堕转速! ( 兰)Q 鱼垦：! )QR S D鲤堂! l垒垒Q l垒Q 咝：墨1螋0 22 2 0 4 62 2 0 4 72 2 0 4 80 0 4 5 40 0 4
10、 5 40 0 4 5 40 0 4 5 400 311 9 8 011 9 8 111 9 8 00 0 8 3 50 40 50 6O 70 80 91 O1 11 21 31 48 2 9 98 2 9 98 2 9 96 3 2 66 3 2 66 3 2 65 1 1 15 1 1 25 1 1 24 2 9 04 2 9 04 2 9 03 6 9 33 6 9 33 6 9 23 2 7 33 2 7 23 2 7 42 9 0 72 9 0 82 9 0 60 1 2 0 50 1 5 8 10 1 9 5 70 2 3 3 l0 2 7 0 80 3 0 5 50 3 4 4
11、 02 5 9 92 5 9 92 5 9 90 3 8 4 82 3 4 32 3 4 32 3 4 42 1 5 O2 1 5 12 1 5 00 4 2 6 80 4 6 5 12 0 0 02 0 0 02 0 0 00 5 0 0 00 0 8 3 50 0 8 3 50 1 2 0 50 1 2 0 50 1 5 8 l0 1 5 8 10 1 9 5 60 1 9 5 60 2 3 3 l0 2 3 3 10 2 7 0 80 2 7 0 90 3 0 5 60 3 0 5 40 3 4 3 90 3 4 410 3 8 4 80 3 8 4 80 4 2 6 80 4 2 6
12、60 4 6 4 90 4 6 510 5 0 0 00 5 0 0 00 0 8 3 50 1 2 0 50 1 5 8 10 1 9 5 60 2 3 3 l0 2 7 0 80 3 0 5 50 3 4 4 00 3 8 4 80 4 2 6 70 4 6 5 0O 5 0 0 0000O 0 100 0 20 0 30 0 300 0 20 0 30设恒流泵的转速为X ，测得的流量为Y ，对表中数据进行线性回归处理后，即可得到线性回归方程：Y = 0 3 8 0 X 一0 0 3 2线性的相关系数r = 0 9 9 9 ，可见线性关系良好。灌流液粘度的测定分别测定在2 0 、3 0 。
13、C 、4 0 温度下，蒸馏水流出毛细管的时间t ，并通过查表得到蒸馏水在各温度下的密度和粘度参数，见下表2 2 。9重庆大学硕士学位论文表2 2 蒸馏水在不同温度下的密度、粘度和流出时间T a b l e2 2T h ed e n s i t y , v i s c o s i t ya n df l o wt i m eo fd i s t i l l e dw a t e ri nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 。_ 。_ _ _ _
14、 _ _ - - _ _ - _ _ - - 一TPt l! ( 盟t 口! 竺2丝延2 曼理：坐叠! !垒垒一一一鱼L2 00 9 9 8 210 0 8 7 10 32 0 52 0 62 0 72 0 63 00 9 9 5 68 0 0 4 x1 0 “ 31 6 71 6 61 6 81 6 74 00 9 9 2 26 5 6 1 0 - 31 5 11 蔓! ! 墨：! 型由式( 2 3 ) ，计算出不同温度下的q t p 和t 2 值，根据三点做一直线，得出直线的斜率和截距分别为5 5 1 x 1 0 4 和2 5 8 x 1 0 五，即得毛细管常数A = 5 5 1 x 1
15、0 4 ，B = 2 5 8 x 1 0 2 。另外测得R P M l l 6 4 0 培养液( p = l g c m 3 ) 在3 7 下的流出时间为1 5 2 1 s ，再根据式( 2 3 ) n - J “ 计算出灌流液的粘度1 1 = 6 6 8 4 x 1 0 0 d y n s c m 2 。剪切力的估算根据式( 2 4 ) ，可计算出恒流泵各转速对应的流动剪切力，见图2 4 。墨1 4h勺若R 尽7 钛转速n ( r p m )图2 4 恒流泵转速与剪切力的关系F i g 2 4T h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nr o t a r ys p e e do ff l o wp u m pa n ds h e a rs t r e s s根据上图中的线性回归方程，由实验所需的微血流剪切力1 5 d y n c m 2 ，3 0d y n c m 2 和4 5d y n c m 2 ，可计算得实验相应选择的恒流泵转速分别为0 1 8 r p m ，0 2 8 r p m 和0 3 8 r p m 。1 02 体外模拟微血流培养系统的建立2 4 小结本章基于在体微血管的生理环境( 1 - 5 d y
