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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 柱前衍生法测定复方甘草酸铵 S 分散片的含量作者：周海婴 作者单位：湖南省长沙市宁乡县人民医院药剂科，湖南 长沙 410600【摘要】 目的：建立复方甘草酸铵 S 分散片中甘氨酸和蛋氨酸的高效液相分析方法。方法：采用柱前衍生化高效液相色谱法测定复方甘草酸铵 S 分散片中两种氨基酸含量。结果：复方甘草酸铵S 分散片中甘氨酸浓度为 10.5839.68 mg/ml，蛋氨酸浓度为10.4439.15mg/ml，线性关系良好， r0.99,RSD1.0%, 加样回收率为 99%。结论：用 HPLC 柱前衍生方法测定复方甘草酸铵 S 分散片中甘氨酸及蛋氨酸含量的
2、方法可行。【关键词】 高效液相法；复方甘草酸铵；分散片由于甘氨酸与蛋氨酸的分子结构中都没有共轭结构，无紫外吸收，很难直接建立 HPLC 法检测本品的含量，原复方甘草甜素片的进口注册标准（JX20000079 ）收载甘氨酸的含量测定方法为薄层扫描，蛋氨酸的含量测定方法为滴定法。虽然，薄层扫描法和滴定法均能满足本品中氨基酸含量测定的要求，但这些方法用于制剂的含量测定，还是存在一些不足和局限性，如滴定法受辅料的干扰大，终点颜色难以确定；薄层扫描法具有操作要求高，重复性不好，误差大等缺点。目前国家标准中收载的氨基酸含量测定方法几乎都是采用专门的氨基酸分析测定仪，但该设备价格较高，检测成本高，KKME-
3、专业医学搜索引擎 http:/ 2-4-二硝基氟苯柱前衍生后，经高效液相色谱进行分离和同时检测两种氨基酸的含量，试图建立一种适应更广，稳定性更高，重复性更好的含量检测方法1 。1 材料与方法1.1 仪器与试剂 ：岛津 LC-10AT 型高效液相色谱仪，SPD-10A 紫外检测器。色谱工作站：浙江大学 N2000 色谱管理系统。色谱柱：大连依利特 Hypersil C18 柱（4.6mm200mm） ，粒度5m；检测波长：360nm；流速：1.5ml/min；柱温：室温。2-4-二硝基氟苯：分析纯。复方甘草酸铵 S 分散片（湖南华钠大药厂） 。1.2 方法1.2.1 供试品溶液的配置：取本品 2
4、0 片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于甘氨酸 25mg 与蛋氨酸 25mg） ，置 100ml量瓶中，加水适量，超声处理 25min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 1.0ml，置 10ml 量瓶中，加 0.05mmol/L碳酸氢钠溶液（pH 9.0）1.0ml 及 0.5% 2-4-二硝基氟苯的乙腈溶液1.0ml，置 60水浴中暗处反应 60min，取出，放冷，用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）稀释至刻度，放置 15min，作为供试品溶液。1.2.2 对照品溶液的配置：分别取甘氨酸与蛋氨酸对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每 1ml 中约含甘氨酸与蛋氨酸都为
5、0.25mg 的对照品混合溶液，从精密量取该溶液 1.0ml 起，同供试品溶液依法操作制得对照品溶液。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 测定法：精密量取上述各溶液 10l 注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积分别计算甘氨酸和蛋氨酸的含量。1.2.4 专属性试验：取供试品溶液精密量取该溶液 10l，注入液相色谱仪，记录色谱图。1.2.5 阴性干扰试验：称取处方量的空白辅料（约相当于甘氨酸 25mg 与蛋氨酸 25mg） ，置 100ml 量瓶中，从加水适量起同专属性试验项下供试溶液依法制得空白溶液，精密量取该溶液10l，注入液相色谱仪中，记录色谱图。1.2.6 线性相关性试验：分
6、别精密称取甘氨酸与蛋氨酸对照品适量，置 100ml 量瓶中，从加水适量起同专属性试验项下供试溶液依法制得甘氨酸与蛋氨酸浓度都约为10、15、20、25、30、38g/ml 的对照品混合溶液。分别精密量取上述溶液 10l，注入液相色谱仪中，记录色谱图。以浓度（g/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线图并进行线性回归。1.2.7 精密度试验：取 040405 批样品，研细，称取样品适量（约相当于甘氨酸 25mg 与蛋氨酸 25mg） ，按前法配制，作为供试品溶液，精密量取该溶液 10l 注入液相色谱仪，重复进样 6 次。1.2.8 重复性试验：取 040405 批样品，研细，称取样品适
7、量（约相当于甘氨酸 25mg 与蛋氨酸 25mg） ，共 6 份，置 100ml 量KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 1ml 中约含有甘氨酸与蛋氨酸都为 0.25mg 的对照品混合溶液，从精密量取该溶液 1.0ml 起，同供试品溶液依法操作制得对照品溶液。精密量取上述溶液各 10l 注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算甘氨酸与蛋氨酸的含量。1.2.9 稳定性考察试验：取 040405 批样品，研细，称取样品适量（约相当于甘氨酸 25mg 与蛋氨酸 25mg） ，置 100ml 量瓶中，从加水适量起同精密度试验项下供试溶液方法同法制得供试品溶液，分别于 0、0.5、1、2
8、、4h 精密量取 10l 注入液相色谱仪。1.2.10 加样回收试验：精密称取已知含量的 040405 批复方甘草酸铵 S 分散片样品 (甘氨酸含量 77.0mg/g、蛋氨酸含量77.2mg/g)适量，置 100ml 量瓶中，按高、中、低三种浓度，分别精密加入甘氨酸与蛋氨酸对照品混合溶液(甘氨酸 5.62mg/ml、蛋氨酸5.57mg/ml)2.0ml、2.5ml 、3.0ml ，各平行三份（共 9 份） ，加水适量，超声处理 25min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 1.0ml，置 10ml 量瓶中，加 0.05mol/L 碳酸氢钠溶液（pH 9.0）1.0ml 及 0.
9、5% 2， 4-二硝基氟苯的乙腈溶液 1.0ml，置 60水浴中暗处反应 60min，取出，放冷，用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）稀释至刻度，放置 15min，作为供试品溶液，精密量取该溶液 10l 注入液相色谱仪，记录色谱图；另分别取甘氨酸与蛋氨酸对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每 1ml 中约含甘氨酸与蛋氨酸都为 0.25mg 的对照品混合溶液，从精密量取该溶液 1.0ml 起，同供试KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 三批样品含量测定：取三批样品（040405、040407、040409）各 20 片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于甘氨酸 25mg 与蛋氨酸 25
10、mg） ，置 100ml 量瓶中，加水适量，超声处理 25 分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 1.0ml，置 10ml 量瓶中，加 0.05mol/L 碳酸氢钠溶液（pH 9.0）1.0ml 及 0.5% 2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液 1.0ml，置60水浴中暗处反应 60min，取出，放冷，用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）稀释至刻度，放置 15min，作为供试品溶液，精密量取该溶液10l 注入液相色谱仪，另分别取甘氨酸与蛋氨酸对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每 1ml 中约含甘氨酸与蛋氨酸都为0.25mg 的对照品混合溶液，从精密量取该溶液 1.0ml 起，同
11、供试品溶液依法操作制得对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算甘氨酸和蛋氨酸的含量。2 结果2.1 专属实验：见图 13。结果表明，以上述色谱条件进行测定，理论板数以甘氨酸峰计算为 6115，蛋氨酸为 7272，均大于3000，甘氨酸与前面相邻峰分离度 R1.5。2.2 阴性干扰实验：见图 4。结果表明，在上述色谱条件进行测定，空白辅料对本品的含量测定无干扰。图 4 空白辅料溶液 HPLC 图KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 线性相关性试验：甘氨酸、蛋氨酸的回归方程和相关系数分别为 y=80 703x+2 532.1；R=0.999 4；y=41 810x +879.69；R=0
12、.999 6。结果表明，甘氨酸浓度在10.5839.68mg/ml，蛋氨酸浓度在 10.44 39.15mg/ml 范围内，线性关系良好。2.4 精密度试验：甘氨酸的平均峰面积为 173 579 7，RSD为 0.20%，蛋氨酸平均峰面积为 878 851，RSD 为 0.20%。2.5 重复性试验：甘氨酸的平均含量为 98.99，RSD 为0.63%，蛋氨酸的平均含量为 99.28，RSD 为 0.66%。2.6 稳定性试验：结果表明，衍生后的样品溶液在 4h 内稳定，甘氨酸的 RSD 为 0.12%，蛋氨酸 RSD 为 0.37%。2.7 加回收试验：结果见表 1、表 2。结果表明：本品含
13、量测定方法回收率较好。该方法灵敏、准确、稳定、重复性好，且辅料对含量测定无影响，能够准确测定本品的含量。测定甘氨酸平均回收率为 99.75%，RSD 0.62%；蛋氨酸 99.24%，RSD0.70%。2.8 含量测定：结果见表 3。表 1 复方甘草酸铵 S 分散片中甘氨酸回收率测定结果表 2 复方甘草酸铵 S 分散片中蛋氨酸回收率测定结果表 3 三批样品含量测定结果3 讨论3.1 衍生时条件的确定：衍生化反应原理：在碱性条件下，氨基酸中的氨基能定量地与 2，4-二硝基氟苯反应生成二硝基苯氨酸衍生化产物，在 360nm 处有紫外检测定量。为保证衍生化反应完全，KKME-专业医学搜索引擎 htt
14、p:/ 2，4-二硝基氟苯，但由于衍生化后的溶液中存在过量的 2，4-二硝基氟苯和一定量的副产物，为了尽量减少对本品氨基酸衍生物分离测定的影响，经平行设计四个比例进行试验，确定本品衍生时的最佳用量为氨基酸与 2，4-二硝基氟苯的摩尔比为15。温度是控制衍生化反应的重要影响指标，经平行设计 3 个温度 40、60、80进行试验，最后确定本品衍生时的最佳温度为 60。为了考察时间、pH 值对衍生反应的影响，经平行设计四个时间和 4 个 pH 值进行试验，确定本品衍生时的最佳反应时间为 1小时、最佳 PH 值为 9.0。3.2 检测波长的确定：甘氨酸、蛋氨酸和复方甘草酸铵 S分散片溶液均在 360n
15、m 波长处有最大吸收，且空白辅料溶液在此波长处无吸收，不干扰含量测定，故选 360nm 作为本品含量测定的最佳检测波长。3.3 不同检测方法的比较：通过 HPLC 法与 TLC 法检测含量结果表明，两种方法都能测定本品的含量，但采用高效液相色谱法在同一色谱条件下检测两者的含量，干扰因素少，更加简单、科学、准确，适合于本品中甘氨酸与蛋氨酸的含量测定。3.4 流动相的选择：从甘氨酸与蛋氨酸的性质可知，两者衍生后的产物极性相差较大。经试验发现单独以不同比例的甲醇-缓冲盐或乙腈-缓冲盐体系作为流动相都不很理想，或蛋氨酸保留时间KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 缓冲盐的混合溶剂作为流动相，结果比较理想，能满足本品的含量测定要求，故最后确定本品氨基酸含量测定的流动相为：0.025mol/L 醋酸钠溶液（用醋酸调节 pH 值至 6.0）- 甲醇-乙腈（60
