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1、Page 0无菌检验及控制无菌检验及控制无菌检验及控制无菌检验及控制王旭王旭2008Page 1教程目的教程目的1.GMP检查中常见的缺陷1.GMP检查中常见的缺陷2.无菌检验的局限性2.无菌检验的局限性3.无菌检验样品的取样控制3.无菌检验样品的取样控制4.无菌检验用培养基及其灵敏度检查4.无菌检验用培养基及其灵敏度检查5.无菌检查方法和验证5.无菌检查方法和验证6.无菌检验过程中的污染控制6.无菌检验过程中的污染控制7.无菌检验阳性结果的调查7.无菌检验阳性结果的调查Page 21 GMP检查中常见的缺陷1 GMP检查中常见的缺陷Page 32. 何为无菌2. 何为无菌理论上:理论上: 无
2、菌 = 完全没有生命无菌 = 完全没有生命而实际上:而实际上: 我们无法证明产品中没有活微生物存在我们无法证明产品中没有活微生物存在无法对整批进行100%检验无法对整批进行100%检验无菌检验的结果只是一个基于无菌检验的结果只是一个基于“可能性可能性”的判断的判断无菌检验用培养基有其局限性无菌检验用培养基有其局限性 只进行细菌和真菌的检验只进行细菌和真菌的检验 对实验结果的判定是基于对实验结果的判定是基于“是否在培养基中生长是否在培养基中生长”我们的工作环境及操作是在相对无菌的状态我们的工作环境及操作是在相对无菌的状态Page 43. 无菌检验 _ 3. 无菌检验 _ 取样计划取样计划我们期望
3、什么?我们期望什么? 在整批产品中无微生物存在。在整批产品中无微生物存在。我们做的是什么测试?我们做的是什么测试? 无菌检验是一个破坏性的实验无菌检验是一个破坏性的实验 我们不能对 整批进行100%检验。我们不能对 整批进行100%检验。如何通过无菌检验来证明整批产品无菌？如何通过无菌检验来证明整批产品无菌？ 要求有一个取样计划来涵盖整个批号。要求有一个取样计划来涵盖整个批号。 有足够的取样量和检验量有足够的取样量和检验量Page 53. 无菌检验 _ 3. 无菌检验 _ 取样计划取样计划什么是批?什么是批?在同一条件下制备出的密封容器的集合（具 有同质性），其每个单位容器被污染的几率 是一样
4、的。在同一条件下制备出的密封容器的集合（具 有同质性），其每个单位容器被污染的几率 是一样的。如何对批进行取样？如何对批进行取样？用于无菌检验的样品必须具有批代表性，但 尤其要考虑从最易污染的位置取样（摘自英 国药典）用于无菌检验的样品必须具有批代表性，但 尤其要考虑从最易污染的位置取样（摘自英 国药典）Page 63. 无菌检验_ 3. 无菌检验_ 取样计划取样计划 何时取? 如何取?何时取? 如何取?无菌灌装产品：无菌灌装产品： 批开始、结束及重大故障和调整后。批开始、结束及重大故障和调整后。 最多24小时为一批 USP .最多24小时为一批 USP . 每天灌装的产品应分别做无菌检验.每
5、天灌装的产品应分别做无菌检验.最终灭菌产品：最终灭菌产品： 从灭菌柜中最冷点取样。从灭菌柜中最冷点取样。 对经不同灭菌柜灭菌的产品应分别进行无菌检验。对经不同灭菌柜灭菌的产品应分别进行无菌检验。连续工艺：连续工艺： 产品被连续地单个灭菌，如：用电子束灭菌，一 批不大于24小时。产品被连续地单个灭菌，如：用电子束灭菌，一 批不大于24小时。Page 73.无菌检验 _ 3.无菌检验 _ 取样计划取样计划取多少样 （检验数量）?取多少样 （检验数量）? 药典上规定每次无菌检验的最少取样数量药典上规定每次无菌检验的最少取样数量 取决于批量，如：中国药典2005版 ，注射剂：取决于批量，如：中国药典2
6、005版 ，注射剂：?大于500：取2% 或20支（取少），用于每个培养基检验大于500：取2% 或20支（取少），用于每个培养基检验?小于等于100：取10%或4个（取多），用于每个培养基检验小于等于100：取10%或4个（取多），用于每个培养基检验 取决于剂量. 取决于剂量. ?如：中国药典2005版 ，剂量小于1毫升， 就要取40支如：中国药典2005版 ，剂量小于1毫升， 就要取40支 同时要考虑检验损耗和复试同时要考虑检验损耗和复试Page 83. 无菌检验 _ 3. 无菌检验 _ 取样计划取样计划每个样品测多少? （检验量）每个样品测多少? （检验量） 药典上规定了每次检验的供试品
7、总量，如： 中国药典2005版药典上规定了每次检验的供试品总量，如： 中国药典2005版 装量小于 1 ml：每支样接入每个培养基为 全量装量小于 1 ml：每支样接入每个培养基为 全量 装量大于等于 1 ml.装量大于等于 1 ml. EP: 半量，但不超过20 ml. EP: 半量，但不超过20 ml. CP: 半量， 2 to 500 mlCP: 半量， 2 to 500 ml USP: USP: Page 93.无菌检验 _ 3.无菌检验 _ 取样计划取样计划取样的局限性取样的局限性相对于整个批量而言，取样的数量是十分 有限的，如：相对于整个批量而言，取样的数量是十分 有限的，如： 若
8、在有1%产品污染的批号中取20个样品进行 检验，80%的可能无菌检验通过。若在有1%产品污染的批号中取20个样品进行 检验，80%的可能无菌检验通过。 若在有5%产品污染的批号中取20个样品进行 检验，30%的可能无菌检验通过。若在有5%产品污染的批号中取20个样品进行 检验，30%的可能无菌检验通过。无菌检验通过的可能性是基于整批产品的 受污染程度。无菌检验通过的可能性是基于整批产品的 受污染程度。Page 103.无菌检验 _ 3.无菌检验 _ 取样计划取样计划 取样的局限性 cont.取样的局限性 cont.检验数量多少影响检验通过与否。检验数量多少影响检验通过与否。检验量的降低会使检出
9、率降低。检验量的降低会使检出率降低。无菌检验只能给出该批产品使污染的程度。无菌检验只能给出该批产品使污染的程度。无菌检验通过只能说明被测样品无菌，不 能证明整批无菌。无菌检验通过只能说明被测样品无菌，不 能证明整批无菌。Page 113.无菌检验 _ 3.无菌检验 _ 取样计划取样计划结论:结论: 要有一个完整的取样计划涵盖整个批生 产过程，并要考虑到要有一个完整的取样计划涵盖整个批生 产过程，并要考虑到“最坏情况最坏情况”以提高 检出可能性。以提高 检出可能性。 检验数量和检验量应满足药典要求。检验数量和检验量应满足药典要求。Page 124. 无菌检验 _ 4. 无菌检验 _ 培养基培养基
10、我们期望什么?我们期望什么? 在整批产品中无微生物存在。在整批产品中无微生物存在。我们做的是什么测试?我们做的是什么测试? 无菌检验是通过目检微生物在培养基中的生长来 判断结果。无菌检验是通过目检微生物在培养基中的生长来 判断结果。如何通过无菌检验来证明整批产品无菌？如何通过无菌检验来证明整批产品无菌？ 能支持微生物生长并无菌_ 能支持微生物生长并无菌_ 培养基的灵敏度检查培养基的灵敏度检查。 培养基的保存控制培养基的保存控制 无抑制微生物生长的因素存在_ 无抑制微生物生长的因素存在_ 方法验证试验方法验证试验Page 134.无菌检验 _ 4.无菌检验 _ 培养基培养基检验用培养基检验用培养
11、基两种微生物培养基：两种微生物培养基：用于真菌培养的改良马丁培养基，培养温度： 23-28oC。用于真菌培养的改良马丁培养基，培养温度： 23-28oC。用于厌氧和需氧细菌培养的硫乙醇酸盐流体 培养基，培养温度：30-35oC。用于厌氧和需氧细菌培养的硫乙醇酸盐流体 培养基，培养温度：30-35oC。Page 144.无菌检验 _ 4.无菌检验 _ 培养基培养基 培养基的灵敏度检查培养基的灵敏度检查 所有培养基必须无菌所有培养基必须无菌 从每批培养基中随机取样，培养14天：中国药典5瓶；美国药 典10%或20瓶（取少）。从每批培养基中随机取样，培养14天：中国药典5瓶；美国药 典10%或20瓶
12、（取少）。按药典要求所列的菌种表，证明培养基灵敏度。按药典要求所列的菌种表，证明培养基灵敏度。 接种 10-100 cfu 需氧菌- 金葡、铜绿和枯草接种 10-100 cfu 需氧菌- 金葡、铜绿和枯草- -至FT 30 至FT 30 35 35 C 培养 3 daysC 培养 3 days接种 10-100cfu 厌氧菌- 生孢梭菌- 至 FT 30 接种 10-100cfu 厌氧菌- 生孢梭菌- 至 FT 30 35 35 C 培 养3 daysC 培 养3 days 接种 10-100cfu 真菌- 白念、黑曲霉接种 10-100cfu 真菌- 白念、黑曲霉 至 UM 23 至 UM
13、23 28 28 C 培养 5 daysC 培养 5 days要求从生产环境中分离出的典型菌株要求从生产环境中分离出的典型菌株在培养基中生长良好在培养基中生长良好 所用菌株传代次数小于等于5代所用菌株传代次数小于等于5代Page 154.无菌检验 _ 4.无菌检验 _ 培养基培养基培养基保存控制培养基保存控制 应规定保存有效期:应规定保存有效期: 在密闭容器中一年，并在灵敏度检查后3月内 使用在密闭容器中一年，并在灵敏度检查后3月内 使用防氧化防氧化 选择长宽比例恰当的容器，以减少与空气的接 触面选择长宽比例恰当的容器，以减少与空气的接 触面 2-25保存2-25保存确保pH确保pH 在密闭容
14、器中保存在密闭容器中保存Page 164.无菌检验 _ 4.无菌检验 _ 培养基培养基无菌检验用培养基的局限性；无菌检验用培养基的局限性；药典规定的培养基所能支持生长的微生物是有限的。药典规定的培养基所能支持生长的微生物是有限的。微生物包括：原生生物、细菌、真菌、支原体和病 毒等。微生物包括：原生生物、细菌、真菌、支原体和病 毒等。这些微生物有广泛的生长要求，如：营养、温度、 氧等这些微生物有广泛的生长要求，如：营养、温度、 氧等无菌检验培养基不可能支持所有微生物的生长，它 们只是针对于那些最有可能污染药品和在药品中生 长的微生物。无菌检验培养基不可能支持所有微生物的生长，它 们只是针对于那些
15、最有可能污染药品和在药品中生 长的微生物。Page 174.无菌检验 _ 4.无菌检验 _ 培养基培养基结论:结论: 在无菌检验中使用两种微生物培养基在无菌检验中使用两种微生物培养基 每批灭菌后都应进行灵敏度检查每批灭菌后都应进行灵敏度检查 有效控制微生物培养基的保存和效期有效控制微生物培养基的保存和效期 方法验证证明在当前实验条件下，对产品 的无菌检验没有抑菌因素的干扰方法验证证明在当前实验条件下，对产品 的无菌检验没有抑菌因素的干扰Page 185. 无菌检验 _ 5. 无菌检验 _ 方法方法药典规定两种方法:药典规定两种方法:直接接种法: 样品直接移入无菌培养基中直接接种法: 样品直接移
16、入无菌培养基中薄膜过滤法 _ 80% of activities薄膜过滤法 _ 80% of activities 产品用0.45m膜过滤并用3x 100ml无菌蛋白胨水 淋洗后加入培养基。膜的选择应保证膜在使用前 后的完整性。产品用0.45m膜过滤并用3x 100ml无菌蛋白胨水 淋洗后加入培养基。膜的选择应保证膜在使用前 后的完整性。替代方法:替代方法: 生物指示剂替代法：以菌片替代产品进行无菌检 查 （一般只用于器械）菌片放置位置需要验证生物指示剂替代法：以菌片替代产品进行无菌检 查 （一般只用于器械）菌片放置位置需要验证Page 195.无菌检验 _ 5.无菌检验 _ 方法方法 直接接种法直接接种法用于不能过滤的样品用于不能过滤的样品若样品本身的混浊，可能要求再培养- 延长了检验 周期若样品本身的混浊，可能要求再培养- 延长了检验 周期样品的检验量有限制，接种体
