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1、1沙枣黄酮的提取及其抗氧化作用的研究作者：李红，郅洁，马彦梅，李炳奇，刘红，龚晓武【摘要 】 目的对沙枣黄酮的抗氧化作用进行研究。方法以 70%乙醇为溶剂，超声辅助法提取沙枣中的黄酮，用比色法测定其含量为 0.928%；采用比色法测定沙枣黄酮对 OH、O-2和 DPPH 等 3种自由基的清除作用。结果沙枣黄酮对 3 种自由基都有明显的清除作用，清除能力为 DPPHO-2OH。结论清除率与浓度存在明显的量效关系，当浓度为 0.4 mgml-1 时，其清除率OH 为76.07%，O-2为 79.53%，DPPH为 93.91%。 【关键词】 沙枣； 黄酮； 抗氧化性沙枣 Elaeagnus ang
2、ustifolia L.T 属胡颓子科(Elaeagnaceae)胡颓子属(Elaeagllt L.)，耐盐碱、生长快、易繁殖，药用价值高，在新疆的塔克拉玛干沙漠及各河流沿岸(且末、若羌、民丰、英吉沙、阿克苏)和伊犁、托克逊等地广泛分布1 。酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用2,3 。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。但是2关于沙枣黄酮抗氧化方面的研究尚未见报道。本研究将沙枣黄酮对 3 种不同自由基的清除能力进行了一个较为全
3、面、系统的研究，从而探讨沙枣黄酮的抗氧化作用，为进一步筛选天然植物抗氧化剂奠定了一定的基础。1 材料1.1 试剂乙醇(A.R)，氢氧化钠(A.R)，亚硝酸钠(A.R) ，硝酸铝(A.R) ，pH 8.2 Tris-HCl 缓冲液(A.R)，0.02%双氧水(A.R)；7 mmol L-1 邻苯三酚(A.R)；pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液（PBS,A.R)；1.5 mmol L-1 邻二氮菲(A.R) ；210-4molL-1 的 DPPH（二苯基苦基苯肼,Sigma 公司生产） 。1.2 仪器 TDL-5 型低速台式离心机（上海隆拓仪器设备有限公司） ；赛多利斯电子天平（德国 Sartoriu
4、s） ；岛津 UV-2401PC 型紫外分光光度计（日本岛津公司生产） ；R-200 型旋转薄膜蒸发器（瑞士 BUCHI ） ；eppendorf 手动可调程单道移液器（德国艾本德股份公司） ；DL-360A 型超声波清洗器（上海之信仪器有限公司） ；SHZ-C 型循环水真空泵（河南豫华仪器有限公司） ；HH-S 型恒温水浴锅（陕西太康生物科技有限公司） 。2 方法32.1 黄酮的含量测定方法2.1.1 对照品溶液的制备精密称取芦丁标准品适量，用甲醇溶解，定容于 50 ml 容量瓶中，制得浓度为 0.2 mg ml-1 的对照品溶液。2.1.2 最大吸收峰的确定精确吸取芦丁对照品溶液 2 ml
5、,加 5%亚硝酸钠溶液 0.3 ml，摇匀后静置 6 min，加 10%硝酸铝溶液 0.3 ml，摇匀后静置 6 min，加 10%氢氧化钠溶液 4.0 ml，用蒸馏水定容至 10 ml，摇匀，放置 15 min，于 400600 nm 波长处扫描，结果在 510 nm 处有最大吸收。2.1.3 标准曲线的绘制精确吸取 0.20 mgml-1 芦丁对照品溶液 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0 ，5.0 ml，分别加入 5%亚硝酸钠溶液0.3 ml 摇匀，放置 6 min，再加入 10%硝酸铝溶液 0.3 ml 摇匀，放置 6 min，最后加入 10%氢氧化钠溶液 4.0 ml，用蒸馏水定
6、容至10 ml，摇匀，放置 15 min，在 510 nm 处测定其吸光度值。以吸收度为纵坐标，对照品溶液的浓度（mgml-1 ）为横坐标，得线性回归方程：Y=9.735X -0.011 5，r=0.999 9。2.1.4 黄酮的提取准确称取粉末 30.00 g，按料液比 1104加入 70%乙醇浸泡 30 min，超声提取 1 h， 过滤后得滤液和滤渣。滤渣再按上述方法提取 2 次，浓缩，定溶至 50 ml 容量瓶，作为试样液。2.1.5 黄酮的含量测定取试样液 2 ml 于 10 ml 容量瓶中，加入 5%亚硝酸钠溶液 0.3 ml，摇匀，放置 6 min；再加入 10%硝酸铝溶液 0.3
7、 ml，摇匀，放置 6 min；最后加入 10%氢氧化钠溶液4.0 ml，用蒸馏水定容至 10 ml，摇匀，放置 15 min；在 510 nm处测定其吸光度值。根据标准曲线计算得沙枣果肉黄酮含量为0.928%。2.2 自由基的生成及清除率的测定2.2.1 羟自由基的生成及清除率的测定4精密量取 2.0 ml PBS 磷酸盐缓冲溶液 (pH=7.4，下同)和 4.0 ml 蒸馏水于试管中，混匀作空白参比管；精密量取 2.0 ml PBS，1.0 ml 邻二氮菲(1.5 mmol L-1，下同)、1.0 ml FeSO4(1.5 mmol L-1，下同)和 2.0 ml 蒸馏水于试管中，混匀作未
8、损伤管；精密量取 2.0 ml PBS，1.0 ml 邻二氮菲，1.0 ml FeSO4，1.0 ml 蒸馏水和 1.0 ml H2O2(0.02%)于试管中，混匀作损伤管；精密量取 2.0 ml PBS，1.0 ml 样品液和3.0 ml 蒸馏水于试管中，混匀作样品参比管；精密量取 2.0 ml PBS、1.0 ml 邻二氮菲，1.0 ml FeSO4，1.0 ml 黄酮试样液和 1.0 5ml H2O2 于试管中，混匀作样品管。将上述试管置于恒温水锅中，37保温 60 min，于波长 536 nm 处测吸光度 (A)值，每种处理重复 5 次，用其平均值按下式计算羟自由基清除率。以 VitC
9、 作对照。羟自由基清除率（%）=(A 样品-A 样参)-(A 损伤-A 空参)/(A 未损-A 损伤)100%2.2.2 超氧阴离子自由基的生成及清除率的测定5采用邻苯三酚自氧化法，精密量取 Tris-HCl 缓冲溶液 (50 mmol L-1，pH 8.2)4.5 ml 和 0.1 ml 药液于试管中，混匀后在室温下平衡 4 min，然后于 325 nm 处测定吸光值 Aj；精密量取 Tris-HCl 缓冲溶液 4.5 ml 向其中加入 3 ml 邻苯三酚（7 mmol L-1） ，反应平衡 4 min，于 325 nm 处测得反应体系的吸光值 A0。按照上述方法，精密量取4.5 ml Tr
10、is-HCl 缓冲溶液和 0.1 ml 药液，混匀后在室温下放置 4 min，立即加入 3 ml 邻苯三酚并开始计时，以 10 mmol L-1 HCl为参比，于 325 nm 处每隔 30 s 测定反应体系的吸光值 A，共记录前 6 min；实验重复 5 次，求其平均值。按下式计算超氧阴离子自由基清除率(I)。以 VitC 作对照。I(%)=(A0A Aj)/A0100%2.2.3 DPPH自由基的生成及清除率的测定6,7 取上述黄6酮试样液 2 ml 及浓度为 210-4 molL-1 的 DPPH 溶液 2ml 先后加入同一具塞试管中，30 min 后以样品提取溶剂为空白调零测定其吸光度
11、 Ai；测定 2 ml 浓度为 210-4 molL-1 的 DPPH 溶液与 2 ml 70%乙醇混合液的吸光度 Ac；再测定 2 ml 黄酮提取液与 2 ml无水乙醇混合液的吸光度 Aj,重复 5 次，求其平均值。根据下列公式计算沙枣黄酮提取液对 DPPH 的抑制率，即：抑制率(%)=1-(Ai-Aj)/Ac100。3 结果3.1 沙枣黄酮对羟自由基的清除作用沙枣黄酮对羟自由基的清除效果见图 1。由图 1 可知，沙枣黄酮对OH 自由基的清除作用始终表现为浓度依赖性的清除作用，而且清除作用很强，远高于同浓度的VitC。3.2 沙枣黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用沙枣黄酮对超氧阴离子自由基的清
12、除效果见图 2。图 2 表现的是反应开始 1 min 时沙枣黄酮对 O-2的清除作用。由图 2 可知，沙枣黄酮对 O-2有较强的清除能力，与同等条件下的 VitC 相比，效果显著。当样品溶液浓度为 0.6 mg ml-1 时，7清除率已达到 87.62%。3.3 沙枣黄酮对 DPPH自由基的清除作用 沙枣黄酮对DPPH自由基的清除效果见图 3。以脂溶性抗氧化剂 VitE 作对照，研究了沙枣黄酮对 DPPH的清除作用。结果如图 3。由图 3 可知,沙枣黄酮对 DPPH具有很明显的清除作用，且清除效果随着浓度的增加而增大，且远远高于同浓度的 VitE。在浓度为 0.025 mgml-1 时，沙枣黄
13、酮对 DPPH的清除率已经远超过 60%。4 结论本研究表明，沙枣黄酮对OH、O-2和 DPPH均具有明显的清除作用，而且对自由基的清除作用随着黄酮液浓度的增加而增强。当浓度为 0.4 mgml-1 时，其清除率OH 为 76.07%,O-2为79.53%，DPPH 为 93.91%。沙枣黄酮有很强的抗氧化活性，对自由基的清除能力总体强弱趋势是：DPPHO-2OH 。沙枣在新疆蕴藏量大，是一种纯天然绿色野生植物。因此，可以开发沙枣作为日常生活中常用的饮品，这对预防和治疗衰老性疾病有一定的作用，而沙枣黄酮提取液对多种自由基均具有较强的8清除能力，因此沙枣作为一种有效的自由基清除剂，是我们理想的天
14、然抗氧化剂之一，具有很好的开发应用前景。【参考文献】1刘天慰，张天峰.太原植物志M.北京:中国科学技术出版社，1992.2黄锁义，黎海妮，余美料，等.益母草总黄酮的提取及鉴别J.时珍国医国药， 2005， 16(5): 398.3黄锁义，覃成箭，姚小敏，等.洋葱总黄酮的提取及鉴别J. 时珍国医国药， 2006， 17(2): 224.4蔡仲军，陈仕江，伊定华，等.不同产地冬虫夏草清除羟自由基作用的研究J.中草药，2004，35(1):57.5李明静，庆伟霞，杨玉霞，等.七种天然黄酮类化合物对超氧阴离子自由基的清除活性J.化学研究，2006，17(4)：70.6CHOI C W，KIM S C，
15、HWANG S S，et al. Antioxidan activity and free radical scavenging capacity between korean medicinal plants and flavonoids by 9assayguided comparisonJ .Plant Science， 2002， 163: 1161.7LU Yinrong，FOO L Y. Antioxidant and radical scavenging activities of polypHenols from apple pomaceJ.Food Chemistry， 2000， 68: 81.
