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1、第三军医大学博士学位论文人内毒素结合肽突变体的构建及其 抗内毒素活性研究摘要内毒素( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，L P S ) 激活单核巨噬细胞引起的细胞因子过度释放是临床上全身性炎症反应综合征( s y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e ，S I R S ) 或脓毒症的主要触发因素。S I R S 或脓毒症具有较高的发病率与死亡率，而临床上目前尚无有效的防治措施，所以针对该问题的防治性研究一直是临床医学关注的热点。脂多糖结合蛋白( 1 i p o p
2、 o l y s a c c h a r i d eb i n d i n gp r o t e i n ，L B P ) 对L P S 的毒性作用具有催化放大效应，含有特异性L P S 结合位点的多肽可以通过阻断L B P L P S 相互作用来拮抗L P S 的毒性作用，是抗内毒素作用的有效手段。L P S 分子具有富含负电荷磷酸基团及疏水性长链脂肪酸的特征，容易结合带正电荷及疏水性较强的分子。国外多项研究报道，L B P 、B P I 及L A L F 等天然内毒素结合蛋白的衍生肽均具有高正电荷数及疏水性，可以通过阻断L P S 与L B P 的结合来抑制L P S 诱发的体内外炎性反应
3、。目前已经明确，L B P l 0 9 1 3 3 氨基酸区域是L B P 与内毒素结合的主要区域，对应于此区域的多肽( 命名为E B P ) 经本室以前的研究证实具有中和内毒素活性。在此基础上，为了进一步提高其生物活性，作者借助于D N A s i s 软件，设计了具有更强正电荷及疏水性的突变体m E B P ，使其更易于结合L P S ；并对E B P 及m E B P 进行克隆表达以研究其抗内毒素活性。实验中将E B P 一级结构中的酸性及中性氨基酸用赖氨酸替换后，应用D N A s i s 软件计算预突变体的等电点与疏水性，筛选具有高正电荷数及疏水性的突变体m E B P ；通过基因定
4、点诱变技术获得m E B P 对应的基因片断，构建P i n p o i n t X a 3 m E B P 表达质粒，转化D H 5Q 菌，在此基础上筛选目的基因高表达株，I P T G 诱导表达；对以包涵体形式表达的两种蛋白进行分离并亲和层析纯化；经凝血酶X a 切割获得2 种目的肽E B P 及m E B P ，两步纯化后对m E B P 进行氨基末端1 0 个氨基酸序列测定；最后应用新鲜人外周血分离的单个核细胞及烧伤复合内毒素血症小鼠进行体内外抗内毒素活性检测，对比研究E B P 及m E B P 的生物学功能。主要研究结果及结论如下：1 E B P 基因第1 3 ，5 4 位C 替换
5、为A ，对应肽的5 ，1 8 位谷氨酰胺替换为赖氨酸后，D N A s i s 分析等电点由突变前的12 ，2 4 变为12 2 6 ，所带正电荷数由+ 6 增至+ 8 ，第三军医大学博士学位论文平均疏水性由0 1 3 增为O 3 3 ，确定为预突变体。2 以含E B P 基因的质粒为模板进行P C R 定点突变，获得突变体m E B P 基因，将其克隆入原核融合表达载体P i n p o i n t X a 。3 ，经酶切及测序鉴定，成功构建重组质粒。3 氯化钙法将表达载体转化大肠杆菌D H 5 a ，筛选转化克隆，以0 2 m m o l LI P T G诱导2 种融合蛋白表达5 小时，优
6、化表达条件，结果目的蛋白以包涵体形式获得高表达。S D S P I A G E 电泳及W e s t e r n b l o t 鉴定结果显示在1 6 5 l ( D 位置有特异性蛋白条带。4 分离溶解包涵体获得融合蛋白，用抗生物素树脂S o f l l i n k T MR e l e a s eA v i d i nR e s i n亲和层析纯化，得到浓度大于8 5 的融合蛋白。因子X a 切割融合蛋白使目的肽与融合伴侣分开，亲和层析纯化及反相高压液相色谱纯化，分别获得9 8 以上纯度的E B P与m E B P 。5 对比研究E B P 与m E B P 的体内外生物活性：( 1 ) m
7、 E B P 较等浓度E B P 具有更好的结合内毒素能力。( 2 ) 1 2 5 u g m l 的E B P 及2 、5 、1 2 5 u g m l 的m E B P 均有明显抑制单核细胞分泌I L - 6 及T N F Q 的作用( I L 6 ：P 0 0 5 ) 。( 3 ) 在模型小鼠体内，5 m g k g 及l O m g k g 浓度的m E B P 或E B P 均有显著抑制细胞因子释放的效应，其中5 m g k gm E B P 处理组小鼠体内细胞因子浓度( I L 6 ：1 6 8 士2 6 ，T N F 仅：2 9 5 + 3 8 )显著低于等浓度E B P 处理组
8、( I L 6 ：3 0 1 士4 2 ，T N F 0 【：5 4 1 士4 3 ) ( P 0 0 5 ) ；( 3 ) C o m p a r e dw i t hm o d e lm i c e ，T N F - aa n dI L 一6r e l e a s ei ng r o u p st r e a t e db y5 m g k ga n d10 m g k gE B Po rm E B Pw e r ei n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l y C y t o k i n e sc o n c e n t r a t i o ni n
9、m i c et r e a t e db y5 m g k gm E B P ( I L - 6 ：16 8 士2 6 ，T N F - a ：2 9 5 士3 8 、d e c r e a s e dm o r es i g n i f i c a n t l yt h a nt h a tt r e a t e db y5 m g k gE B P ( I L 一6 ：3 0 1 4 2 ，T N F 一。【：5 4 1 1 4 3 ) ( P 0 0 5 ) ( 图3 3 ，表3 1 ) 。表3 1 不伺浓度E B P 和m E B P 对L P S 诱导的P B M C 细胞分泌I
10、L 6 、T N F a 的影响E f r e c to fd i f f e r e n tc o n t e n t r a t i o nE B Pa n dm E B Po nI I n 6a n dT N Fr e l e a s eG r o u pC o n t e n t so fl L 6a n dT N F - a ( p g m l 、I L 6T N F a注：p O0 5 ) ( 表3 - 2 ，罔3 - 4 ) 。表3 - 2E B P 干m E B P 对小鼠体山I L 一6 及T N F - 释放的影响T a b l e 3 ，2E f f e c lo f E
11、 B Pa n d m E B P o f f I L - 6a n d T N F qr e l e a s e l n m o u s eG 竺竺1 1 竺竺型。“9 ?宅1 | | i 甚7 0 0 囊黜m4 0 0 聪0口I L6 T N F 曲矗语蔷 8j 夕4 m p 0 0 5 ) ，说明1 2 5 u g m l 的m E B P 有较为肯定的抑制内毒素刺激后靶细胞释放第三军医大学博士学位论文细胞因子的效应。二、E B P 年I I m E B P 对烧伤复合内毒素血症小鼠的保护作用在体内，T N F O t 发挥活性作用表现为对L P S 的依赖或协同效应，是脓毒症中介导组织
12、器官损害的主要介质之一【59 1 ，T N F Q 浓度的高低与脓毒症的严重性和后果一致。而I L 6 可做为炎性反应的一个标志，反映机体炎症反应的严重程度【6 0 】。在烧伤复合内毒素动物模型中，体内L P S 及细胞因子浓度的高峰出现于动物处理后6 1 2 d 时【6 0 , 6 1 】，因此本实验选择动物处理后6 小时作为检测细胞因子变化的时间点。实验发现，与正常小鼠相比，模型小鼠处理6 小时后血循环中I L 6 及T N F 0 【浓度显著升高，5 、10 m g k g 的E B P 和m E B P 处理组，小鼠体内T N F 0 【及I L 6 的分泌均得到抑制，其q b 5 m
13、 g k gm E B P 作用后I L 6 及T N F a 的浓度降低较等浓度E B P 作用后明显( p 0 0 5 ) 。提示m E B P 具有较E B P 更理想的体外结合内毒素及抑制内毒素刺激后单核细胞释放细胞因子的作用。5 观察E B P 或m E B P 对烧伤合并内毒素血症小鼠的保护作用：与模型组相比，5 m g k g 及1 0 m g k g E B P 或m E B P 处理组小鼠体内T N F Q 、I L 6 的释放明显得到抑制，第三军医大学博士学位论文其中5 m g & gm E B P 处理组对小鼠体内两种细胞因子的抑制( I L 6 ：1 6 8 + 2 6
14、 ，T N F O 【：2 9 5 + 3 8 ) 较等浓度E B P 作用( I L 6 ：3 0 1 + 4 2 ，T N F a ：5 4 1 + 4 3 ) 显著。R T - P C R 半定量分析结果表明：1 0 m g k g m E B P 具有较强抑制小鼠肝组织内T N F - a m R N A 表达的作用。E B P 或m E B P 对小鼠存活率影响方面：模型小鼠1 2 0 小时内死亡率1 0 0 ，与模型组相比，5 m g & g 及1 0 m g k gm E B P 处理组小鼠存活率分别上升了2 0 及4 0 ，而E B P处理组对小鼠存活率没有影响。与模型组及E
15、B P 处理组相比，m E B P 处理组小鼠脏器组织病理学改变有所减轻。以上结果提示：结合内毒素的分子特征对内毒素结合肽( E B P ) 进行改良，借助于生物信息学软件筛选具有高正电荷数及疏水性的突变体m E B P ，筛选到的内毒素结合肽突变体具有较强特异性及针对性；通过定点突变实现了E B P 基因的体外定向进化；经原核表达获得的小分子L B P 衍生肽具有中和内毒素活性：E B P 及m E B P 均具有体外结合L P S 及抑伟i J L P S 体内外毒性的作用，而通过增加正电荷数及疏水性得到的内毒素结合肽突变体具有较好的拮抗内毒素活性。7 2第三军医大学博士学位论文致谢衷心感
16、谢导师刘友生教授在我读研究生期间给予我的精心指导和关怀、鼓励。三年来，导师对我的培养倾注了大量心血，导师严谨务实的治学态度、忘我的工作热情是我学习的榜样!衷心感谢在课题研究工作中给予我帮助的杨海捷博士、史爱学博士及王长松博士。在病理研究所学习期间，得到了教研室各位老师的的帮助与支持，在此向他们表示诚挚的谢意!最后，感谢家人对我的支持与关爱!第三军医大学博士学位论文参考文献1 C o h e n J T h ei m m u n o p a t h o g e n e s i so fs e p s i s N a t u r e ，2 0 0 2 ，4 2 0 ( 6 9 17 ) ：8 8 5 - 8 9 1 2 U l e v i t c hR J ，T o b i a sP S R e c o g n i t i o no fg r a m n e
